इम्यूनोमॉड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) के एक प्रमुख विशेषता हैं, लेकिन कुछ अपवादन के साथ, ओनके पहचान काफी हद तक अज्ञात रहत हैं। हिंया, हम इन अलग-अलग टीएमई डिब्बन के मेटाबोलोम का प्रकट करै के लिए उच्च-ग्रेड सीरस कार्सिनोमा (एचजीएससी) वाले मरीजन के ट्यूमर अऊर जलोदर से ट्यूमर अऊर टी कोशिका का विश्लेषण किहिन। जलोदर अऊर ट्यूमर कोशिका मा व्यापक चयापचय अंतर होत हैं। जलोदर के तुलना मा, ट्यूमर-घुसपैठ टी कोशिका 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (एमएनए) मा काफी समृद्ध होत हैं। यद्यपि टी कोशिका मा एमएनए का स्तर बढ़ जात है, लेकिन निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफेरेज (एक एंजाइम जवन एस-एडेनोसिलमेथियोनिन से निकोटिनामाइड मा मिथाइल समूहन के हस्तांतरण का उत्प्रेरित करत है) के अभिव्यक्ति फाइब्रोब्लास्ट अऊर ट्यूमर कोशिका तक सीमित है। कार्यात्मक रूप से, एमएनए टी कोशिकाओं का ट्यूमर-प्रोमोटिंग साइटोकाइन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा का स्राव करै के लिए प्रेरित करत है। यहिसे, टीएमई-व्युत्पन्न एमएनए टी कोशिका के प्रतिरक्षा विनियमन मा योगदान देत है अऊर मानव कैंसर के इलाज के लिए एक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करत है।
ट्यूमर-व्युत्पन्न चयापचय एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर एक गहरा निरोधात्मक प्रभाव डाल सकत हैं, अऊर अधिक से अधिक साक्ष्य बतावत हैं कि उ रोग के प्रगति के लिए एक प्रमुख प्रेरक बल के रूप मा भी काम कर सकत हैं (1)। वारबर्ग प्रभाव के अलावा, हाल के काम ट्यूमर कोशिका के चयापचय स्थिति अऊर ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण (टीएमई) के प्रतिरक्षा स्थिति के साथे ओकर संबंध के चिह्नित करै लाग है। माउस मॉडल अऊर मानव टी कोशिका पर अध्ययन से पता चला है कि ग्लूटामाइन चयापचय (2), ऑक्सीडेटिव चयापचय (3) अऊर ग्लूकोज चयापचय (4) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिका उपसमूहन पर स्वतंत्र रूप से कार्य कर सकत हैं। इन मार्गन मा कईयो चयापचय टी कोशिका के एंटी-ट्यूमर कार्य का रोकत हैं। ई साबित होइ चुका है कि कोएंजाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (बीएच 4) के नाकाबंदी टी कोशिका के प्रसार का नुकसान पहुँचा सकत है, अऊर शरीर मा बीएच 4 के वृद्धि सीडी 4 अऊर सीडी 8 द्वारा मध्यस्थता एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का बढ़ा सकत है। यहिके अलावा, काइनुरेनिन के इम्यूनोसप्रेसिव प्रभाव का बीएच 4 (5) के प्रशासन से बचावा जा सकत है। आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजेनेज (आईडीएच) उत्परिवर्ती ग्लियोब्लास्टोमा मा, एनैंटीओमेटाबोलिक (आर)-2-हाइड्रोक्सीग्लूटारेट (आर-2-एचजी) का स्राव टी सेल सक्रियण, प्रसार अऊर कोशिका विघटन गतिविधि (6) का रोकत है। हाल ही में, ई देखा गा है कि मिथाइलग्लाइऑक्सल, ग्लाइकोलाइसिस का एक उप-उत्पाद, मायलोइड मूल के दमनकारी कोशिका द्वारा उत्पादित होत है, अऊर मिथाइलग्लाइऑक्सल के टी सेल हस्तांतरण प्रभावक टी सेल कार्य का रोक सकत है। उपचार मा, मिथाइलग्लाइऑक्सल का बेअसर करब माइलोइड-व्युत्पन्न दमनकारी कोशिका (एमडीएससी) के गतिविधि का दूर कइ सकत है अऊर माउस मॉडल (7) मा चेकपॉइंट नाकाबंदी चिकित्सा का समन्वयात्मक रूप से बढ़ा सकत है। ई अध्ययन सामूहिक रूप से टी सेल कार्य अऊर गतिविधि का विनियमित करै मा टीएमई-व्युत्पन्न चयापचयों के प्रमुख भूमिका पर जोर देत हैं।
डिम्बग्रंथि कैंसर (8) मा टी सेल डिसफंक्शन व्यापक रूप से रिपोर्ट कीन गा है। ई आंशिक रूप से हाइपोक्सिया अऊर असामान्य ट्यूमर संवहनी (9) मा निहित चयापचय विशेषता के कारण है, जेकरे परिणामस्वरूप ग्लूकोज अऊर ट्रिप्टोफैन का लैक्टिक एसिड अऊर काइन्यूरेनिन जइसन उप-उत्पादन मा बदला जात है। अत्यधिक बाह्य कोशिकीय लैक्टेट इंटरफेरॉन-γ (IFN-γ) के उत्पादन का कम करत है अऊर माइलोसप्रेसिव उपसमूहन (10, 11) के भेदभाव का संचालित करत है। ट्रिप्टोफैन के सेवन सीधे टी सेल प्रसार का रोकत है अऊर टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग (12-14) का रोकत है। इन अवलोकन के बावजूद, प्रतिरक्षा चयापचय के आसपास बहुत काम अनुकूलित मीडिया का उपयोग कइके इन विट्रो टी सेल कल्चर मा कीन गा रहा, या विवो मा समरूप माउस मॉडल तक सीमित रहा, जेहिमा से कौनो भी मानव कैंसर अऊर शारीरिक मैक्रो अऊर माइक्रो वातावरण के विषमता का पूरा तरह से दर्शाता नाहीं है।
डिम्बग्रंथि कैंसर के एक आम विशेषता पेरिटोनियल फैलाव अऊर जलोदर के उपस्थिति है। जलोदर मा कोशिका द्रव का संचय उन्नत बीमारी अऊर खराब रोग का निदान से जुड़ा अहै (15)। रिपोर्ट के अनुसार, ई अनूठा डिब्बा हाइपोक्सिक है, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (वीईजीएफ) अऊर इंडोलेमाइन 2,3-डाइऑक्सीजेनेज (आईडीओ) के उच्च स्तर है, अऊर टी नियामक कोशिका अऊर मायलोइड निरोधक कोशिका (15-18) द्वारा घुसपैठ कीन जात है। जलोदर का चयापचय वातावरण ट्यूमर से अलग हो सकत है, यहिसे पेरिटोनियल स्पेस मा टी कोशिका के पुन: प्रोग्रामिंग अस्पष्ट है। यहिके अलावा, ट्यूमर वातावरण मा मौजूद जलोदर अऊर चयापचय के बीच प्रमुख अंतर अऊर विषमता प्रतिरक्षा कोशिका के घुसपैठ अऊर ट्यूमर पर ओनके कार्य मा बाधा डाल सकत है, अऊर आगे के शोध के जरूरत है।
इन समस्याओं का हल करै के खातिर, हम अलग-अलग कोशिका प्रकारन (सीडी 4 + अऊर सीडी 8 + टी कोशिका सहित) के साथ-साथ ट्यूमर के भीतर अऊर बीच के अध्ययन करै के लिए एक संवेदनशील कोशिका पृथक्करण अऊर तरल क्रोमैटोग्राफी टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) विधि डिजाइन किहिन। हम इन प्रमुख आबादी के चयापचय स्थिति का एक अत्यधिक हल चित्र प्रदान करै के लिए उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री अऊर एकल-कोशिका आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) के संयोजन मा ई विधि का उपयोग करत हैं। ई विधि से ट्यूमर टी कोशिका मा 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (एमएनए) के स्तर मा महत्वपूर्ण वृद्धि का पता चला, अऊर इन विट्रो प्रयोगन से पता चला कि टी कोशिका कार्य पर एमएनए के इम्यूनोमॉड्यूलेटरी प्रभाव पहिले अज्ञात रहा। सामान्य तौर पर, ई विधि ट्यूमर अऊर प्रतिरक्षा कोशिका के बीच आपसी चयापचय बातचीत का प्रकट करत है, अऊर प्रतिरक्षा विनियमन चयापचय मा अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान करत है, जवन टी कोशिका-आधारित डिम्बग्रंथि कैंसर इम्यूनोथेरेपी उपचार के अवसरन के इलाज के लिए उपयोगी हो सकत है।
हमने उच्च-आयामी प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग ग्लूकोज अवशोषण [2-(N-(7-नाइट्रोफेनिल-2-ऑक्सा-1,3-डायजा-4-इल)अमीनो)-2-डीऑक्सीग्लूकोज (2-एनबीडीजी) अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि [माइटोट्रैकर डीप रेड (एमटी डीआर)] (एमटीडीआर, 2019, विशिष्ट मार्कर जवन प्रतिरक्षा कोशिका अऊर ट्यूमर कोशिका आबादी का अलग करत हैं (तालिका S2 अऊर चित्र S1A)। ई विश्लेषण से पता चला कि टी कोशिका के तुलना मा, जलोदर अऊर ट्यूमर कोशिका मा ग्लूकोज अवशोषण के स्तर अधिक होत है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि मा छोट अंतर होत है। ट्यूमर कोशिका [CD45-EpCAM (EpCAM)+] का औसत ग्लूकोज अवशोषण टी कोशिका के तुलना मा तीन से चार गुना है, अऊर सीडी 4 + टी कोशिका के औसत ग्लूकोज अवशोषण सीडी 8 + टी कोशिका के तुलना मा 1.2 गुना है, जवन इंगित करत है कि ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट (टीआईएल) के एकै चित्र टीएमई मा भी अलग-अलग चयापचय आवश्यकता होत है (चित्र 1)। यहिके विपरीत, ट्यूमर कोशिका मा माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिका के समान है, अऊर दुइनौ कोशिका प्रकारन के माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिका के तुलना मा अधिक है (चित्र 1 बी)। सामान्य तौर पर, ई परिणाम चयापचय स्तर का प्रकट करत हैं। ट्यूमर कोशिका के चयापचय गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिका के तुलना मा अधिक है, अऊर सीडी 4 + टी कोशिका के चयापचय गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिका के तुलना मा अधिक है। कोशिका प्रकारन मा इन प्रभावन के बावजूद, ट्यूमर के तुलना मा सीडी 4 + अऊर सीडी 8 + टी कोशिका के चयापचय स्थिति या जलोदर मा ओनके सापेक्ष अनुपात मा कौनो सुसंगत अंतर नाहीं है (चित्र 1 सी)। यहिके विपरीत, सीडी 45-कोशिका अंश मा, जलोदर (चित्र 1डी) के तुलना मा ट्यूमर मा ईपीसीएएम+ कोशिका के अनुपात बढ़ गवा। हम EpCAM+ अऊर EpCAM- सेल घटकन के बीच एक स्पष्ट चयापचय अंतर भी देखेन। EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिका मा EpCAM- कोशिका के तुलना मा उच्च ग्लूकोज अपटेक अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि होत है, जवन टीएमई मा ट्यूमर कोशिका मा फाइब्रोब्लास्ट के चयापचय गतिविधि से बहुत अधिक होत है (चित्र 1, ई अऊर एफ)।
(ए अऊर बी) ग्लूकोज अपटेक (2-एनबीडीजी) (ए) अऊर सीडी 4 + टी कोशिका (माइटोट्रैकर डार्क रेड) के माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) (बी) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) अऊर सारणीबद्ध डेटा (दाएं), सीडी 8 + टी कोशिका अऊर ट्यूमर साइट्स अऊर ट्यूमर साइट्स से ईपीसीएएम + सीडी 45-ट्यूमर कोशिका। (सी) जलोदर अऊर ट्यूमर मा सीडी 4 + अऊर सीडी 8 + कोशिका (सीडी 3 + टी कोशिका के) का अनुपात। (D) जलोदर अऊर ट्यूमर (CD45−) मा EpCAM + ट्यूमर कोशिका के अनुपात। (ई अऊर एफ) ईपीसीएएम + सीडी 45-ट्यूमर अऊर ईपीसीएएम-सीडी 45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अपटेक (2-एनबीडीजी) (ई) अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि (माइटोट्रैकर गहरा लाल) (एफ) प्रतिनिधि ग्राफ (बाएं) अऊर सारणीबद्ध डेटा (दाएं) जलोदर अऊर ट्यूमर कोशिका। (जी) प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सीडी 25, सीडी 137 अऊर पीडी 1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि ग्राफ। (एच अऊर आई) सीडी 25, सीडी 137 अऊर पीडी 1 अभिव्यक्ति सीडी 4 + टी कोशिका (एच) अऊर सीडी 8 + टी कोशिका (आई) पर। (जे अऊर के) सीसीआर 7 अऊर सीडी 45 आरओ के अभिव्यक्ति के आधार पर भोला, केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), प्रभावक (टेफ) अऊर प्रभावक स्मृति (टेम) फेनोटाइप। जलोदर अऊर ट्यूमर मा सीडी 4 + टी कोशिका (जे) अऊर सीडी 8 + टी कोशिका (के) के प्रतिनिधि छवि (बाएं) अऊर सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। युग्मित टी-टेस्ट (* पी <0.05, ** पी <0.01 अऊर *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित पी मान। रेखा मिलान कीन गा मरीजन (n = 6) का प्रतिनिधित्व करत है। एफएमओ, प्रतिदीप्ति माइनस एक; एमएफआई, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता।
आगे के विश्लेषण से पता चला कि अत्यधिक हल टी सेल फेनोटाइपिक स्थिति के बीच अन्य महत्वपूर्ण अंतर हैं। ट्यूमर मा सक्रिय (चित्र 1, जी से आई) अऊर प्रभावक स्मृति (चित्र 1, जे अऊर के) जलोदर (सीडी 3 + टी कोशिका के अनुपात) के तुलना मा बहुत अधिक बार होत हैं। इसी तरह, सक्रियण मार्करन (सीडी 25 अऊर सीडी 137) अऊर कमी मार्करन [प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1 (पीडी 1)] के अभिव्यक्ति द्वारा फेनोटाइप का विश्लेषण करत हुए पता चला कि यद्यपि इन आबादी के चयापचय विशेषता अलग-अलग हैं (चित्र एस 1, बी से ई) , लेकिन स्मृति प्रभाव, या चित्र एस 1 के बीच लगातार कौनो महत्वपूर्ण चयापचय अंतर नाहीं देखा गा रहा (चित्र एस 1, मैं)। कोशिका फेनोटाइप (21) का स्वचालित रूप से असाइन करै के लिए मशीन लर्निंग विधियन का उपयोग कइके ई परिणामन के पुष्टि कीन गै रही, जेहिसे आगे रोगी के जलोदर मा बड़ी संख्या मा अस्थि मज्जा कोशिका (सीडी 45 + / सीडी 3- / सीडी 4 + / सीडी 45 आरओ +) के उपस्थिति का पता चला (चित्र एस 2 ए)। सब पहचाने गए कोशिका प्रकारन मा, ई माइलोइड कोशिका आबादी सबसे अधिक ग्लूकोज अवशोषण अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि देखाइस (चित्र एस 2, बी से जी)। ई परिणाम एचजीएससी रोगियन मा जलोदर अऊर ट्यूमर मा पाए जाने वाले कई कोशिका प्रकारन के बीच मजबूत चयापचय अंतर का उजागर करत हैं।
टीआईएल के मेटाबोनोमिक विशेषताओं का समझै मा मुख्य चुनौती ट्यूमर से पर्याप्त शुद्धता, गुणवत्ता अऊर मात्रा के टी सेल नमूना अलग करै के जरूरत है। हाल के अध्ययनन से पता चला है कि प्रवाह साइटोमेट्री के आधार पर छँटाई अऊर बीड संवर्धन विधियन से सेलुलर चयापचय प्रोफाइल (22-24) मा बदलाव होइ सकत है। यहि समस्या का दूर करै के ताईं, हम एलसी-एमएस/एमएस (सामग्री अऊर विधि देखौ; चित्र 2 ए) द्वारा विश्लेषण से पहिले सर्जिकल रूप से कटावा गा मानव डिम्बग्रंथि कैंसर से टीआईएल का अलग अऊर अलग करै के ताईं बीड संवर्धन विधि का अनुकूलित किहिन। चयापचय परिवर्तनन पर ई प्रोटोकॉल के समग्र प्रभाव का आकलन करै के खातिर, हम उपरोक्त मनका पृथक्करण चरण के बाद स्वस्थ दाताओं द्वारा सक्रिय टी कोशिका के चयापचय प्रोफाइल के तुलना ओन कोशिका के साथ किहिन जवन मनका अलग नाहीं रहे लेकिन बर्फ पर रहे। ई गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण से पता चला कि इन दुइनौ स्थितियन (आर = 0.77) के बीच एक उच्च सहसंबंध है, अऊर 86 चयापचय समूह के तकनीकी पुनरावृत्ति मा उच्च दोहराव है (चित्र 2 बी)। यहिसे, ई विधि कोशिका प्रकार संवर्धन से गुजरत कोशिका मा सटीक चयापचय विश्लेषण कर सकत हैं, जेहिसे एचजीएससी मा विशिष्ट चयापचय के पहचान करै के लिए पहिला उच्च-रिज़ॉल्यूशन मंच प्रदान कीन जात है, जेहिसे लोग कोशिका विशिष्टता यौन चयापचय कार्यक्रम के गहरी समझ प्राप्त कर सकत हैं।
(A) चुंबकीय मनका संवर्धन का योजनाबद्ध आरेख। एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण से पहिले, कोशिका चुंबकीय मनका संवर्धन के लगातार तीन दौर से गुजरिहैं या बर्फ पर रहिहैं। (बी) चयापचय के बहुतायत पर संवर्धन प्रकार का प्रभाव। हर संवर्धन प्रकार ± एसई के लिए तीन माप का औसत। ग्रे रेखा 1:1 संबंध का प्रतिनिधित्व करत है। अक्ष लेबल मा देखावा गा बार-बार माप के इंट्रा-क्लास सहसंबंध (आईसीसी)। एनएडी, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड। (सी) रोगी चयापचय विश्लेषण के कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध आरेख। जलोदर या ट्यूमर मरीजन से एकत्रित कीन जात हैं अऊर क्रायोप्रिजर्व कीन जात हैं। प्रत्येक नमूना के एक छोट हिस्सा का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण कीन गा रहा, जबकि शेष नमूना सीडी 4 +, सीडी 8 + अऊर सीडी 45- कोशिका के संवर्धन के तीन दौर से गुजरिन। इन कोशिका अंशों का एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग कइके विश्लेषण कीन गा रहा। (D) मानकीकृत चयापचय बहुतायत का हीट मैप। डेंड्रोग्राम नमूना के बीच यूक्लिडियन दूरी के वार्ड के क्लस्टरिंग का प्रतिनिधित्व करत है। (ई) नमूना चयापचय मानचित्र का प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), हर नमूना के तीन प्रतिकृति देखावत है, एकै रोगी के नमूना एक रेखा से जुड़े हैं। (एफ) रोगी पर वातानुकूलित नमूना के चयापचय प्रोफाइल का पीसीए (यानी, आंशिक अतिरेक का उपयोग करत हुए); नमूना प्रकार उत्तल पतवार द्वारा सीमित है। पीसी1, मुख्य घटक 1; पीसी2, मुख्य घटक 2।
अगला, हम छह एचजीएससी रोगियन के प्राथमिक जलोदर अऊर ट्यूमर मा सीडी 4 +, सीडी 8 + अऊर सीडी 45-कोशिका अंशों मा 99 चयापचयों का विश्लेषण करै के लिए ई संवर्धन विधि का लागू किहिन (चित्र 2 सी, चित्र एस 3 ए अऊर तालिका एस 3 अऊर एस 4)। ब्याज के आबादी जीवित कोशिका के मूल बड़े नमूना के 2% से 70% तक होत है, अऊर कोशिका के अनुपात रोगियन के बीच बहुत भिन्न होत है। मोती का अलग करै के बाद, ब्याज का समृद्ध अंश (सीडी 4+, सीडी 8+ या सीडी 45-) औसतन नमूना मा सब जीवित कोशिका के 85% से अधिक के लिए जिम्मेदार है। ई संवर्धन विधि हमका मानव ट्यूमर ऊतक चयापचय से कोशिका आबादी का विश्लेषण करै के अनुमति देत है, जवन कि बड़े नमूना से करब असंभव है। यहि प्रोटोकॉल का उपयोग करत हुए, हम निर्धारित किहिन कि एल-काइनुरेनिन अऊर एडेनोसिन, ई दुइनौ अच्छी तरह से चिन्हित इम्यूनोसप्रेसिव चयापचय ट्यूमर टी कोशिका या ट्यूमर कोशिका (चित्र एस 3, बी अऊर सी) मा बढ़ जात रहें। यहिसे, ई परिणाम रोगी ऊतकों मा जैविक रूप से महत्वपूर्ण चयापचय पदार्थन का खोजै के लिए हमरे कोशिका पृथक्करण अऊर मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के निष्ठा अऊर क्षमता का दर्शावत हैं।
हमार विश्लेषण से रोगियन के भीतर अऊर बीच कोशिका प्रकारन के एक मजबूत चयापचय पृथक्करण भी पता चला (चित्र 2डी अऊर चित्र एस 4 ए)। विशेष रूप से, अन्य मरीजन के तुलना मा, मरीज 70 अलग-अलग चयापचय विशेषता (चित्र 2 ई अऊर चित्र एस 4 बी) देखाइस, जेसे पता चलत है कि मरीजन के बीच पर्याप्त चयापचय विषमता हो सकत है। ई ध्यान देय लायक है कि अन्य मरीजन (1.2 से 2 लीटर; तालिका S1) के तुलना मा, मरीज 70 (80 मिलीलीटर) मा एकत्रित जलोदर के कुल मात्रा कम रही। प्रमुख घटक विश्लेषण (उदाहरण के लिए, आंशिक अतिरेक विश्लेषण का उपयोग करत हुए) के दौरान अंतर-रोगी विषमता का नियंत्रण कोशिका प्रकारन के बीच सुसंगत परिवर्तन देखावत है, अऊर कोशिका प्रकारन अऊर/या सूक्ष्म पर्यावरण चयापचय प्रोफाइल के अनुसार स्पष्ट रूप से एकत्रित होत हैं (चित्र 2एफ)। एकल चयापचयों के विश्लेषण ने इन प्रभावन पर जोर दिहिस अऊर कोशिका प्रकारन अऊर सूक्ष्म पर्यावरण के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता लगावा। ई ध्यान देय लायक है कि सबसे चरम अंतर देखल गै है एमएनए, जवन आमतौर पर सीडी 45- कोशिका अऊर सीडी 4+ अऊर सीडी 8+ कोशिका मा समृद्ध होत है जवन ट्यूमर मा घुसपैठ करत हैं (चित्र 3 ए)। सीडी 4 + कोशिका के लिए, ई प्रभाव सबसे स्पष्ट है, अऊर सीडी 8 + कोशिका मा एमएनए भी पर्यावरण से बहुत प्रभावित होत है। हालांकि, ई महत्वपूर्ण नाहीं है, काहे से कि छह मरीजन मा से केवल तीन मरीजन का ट्यूमर सीडी 8+ स्कोर के लिए मूल्यांकन कीन जा सकत है। एमएनए के अलावा, जलोदर अऊर ट्यूमर मा विभिन्न प्रकार के कोशिका मा, टीआईएल मा खराब रूप से चिन्हित अन्य चयापचय भी अलग-अलग समृद्ध हैं (चित्र एस 3 अऊर एस 4)। यहिसे, ई डेटा आगे के शोध के लिए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स के एक आशाजनक सेट का प्रकट करत हैं।
(ए) जलोदर अऊर ट्यूमर से सीडी 4+, सीडी 8+ अऊर सीडी 45- कोशिका मा एमएनए के सामान्यीकृत सामग्री। बॉक्स प्लॉट माध्यिका (रेखा), अंतर-चतुर्थक सीमा (फ्रेम काज) अऊर डेटा सीमा, अंतर-चतुर्थक सीमा (फ्रेम मूंछ) के 1.5 गुना तक देखावत है। जैसा कि रोगी सामग्री अऊर विधियन मा वर्णित है, पी मान (* पी <0.05 अऊर ** पी <0.01) का निर्धारित करै के लिए रोगी के लिम्मा मान का उपयोग करा। (बी) एमएनए चयापचय (60) का योजनाबद्ध आरेख। चयापचय: ​​एस-एडेनोसिल-1-मेथियोनिन; एसएएच, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन; एनए, निकोटिनामाइड; एमएनए, 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड; 2-पीवाई, 1-मिथाइल- 2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; 4-पीवाई, 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड; एनआर, निकोटिनामाइड राइबोज; एनएमएन, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लियोटाइड। एंजाइम (हरा): एनएनएमटी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफेरेज; एसआईआरटी, सिरटुइन्स; एनएएमपीटी, निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसिल ट्रांसफरेज; एओएक्स1, एल्डिहाइड ऑक्सीडेज 1; एनआरके, निकोटिनामाइड राइबोसाइड किनेज; एनएमएनएटी, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनिलेट ट्रांसफेरेज; पीएनपी1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज। (सी) जलोदर (ग्रे) अऊर ट्यूमर (लाल; एन = 3 मरीज) के एससीआरएनए-सेक का टी-एसएनई। (D) scRNA-seq का उपयोग कइके पहचाने गए विभिन्न कोशिका आबादी मा NNMT अभिव्यक्ति। (ई) एसके-ओवी-3, मानव भ्रूण गुर्दे (एचईके) 293टी, टी कोशिका अऊर एमएनए-उपचारित टी कोशिका मा एनएनएमटी अऊर एओएक्स 1 के अभिव्यक्ति। मुड़ा अभिव्यक्ति एसके-ओवी-3 के सापेक्ष देखावा गा है। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावा गा है (n = 6 स्वस्थ दाता)। से अधिक सीटी मानन का अज्ञात (यूडी) माना जात है। (एफ) 8एमएम एमएनए से इलाज कीन गा एसके-ओवी-3, एचईके293टी, टी कोशिका अऊर टी कोशिका मा एसएलसी22ए1 अऊर एसएलसी22ए2 के अभिव्यक्ति। मुड़ा अभिव्यक्ति एसके-ओवी-3 के सापेक्ष देखावा गा है। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावा गा है (n = 6 स्वस्थ दाता)। से अधिक सीटी मानन का अज्ञात (यूडी) माना जात है। (जी) एमएनए के साथ ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद सक्रिय स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं में कोशिका एमएनए सामग्री। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावा गा है (n = 4 स्वस्थ दाता)।
एमएनए का उत्पादन निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफेरेज (एनएनएमटी; चित्र 3 बी) द्वारा एस-एडेनोसिल-1-मेथियोनिन (एसएएम) से निकोटिनामाइड (एनए) मा मिथाइल समूह का स्थानांतरित कइके कीन जात है। एनएनएमटी कईयो तरह के मानव कैंसर मा अत्यधिक व्यक्त कीन जात है अऊर ई प्रसार, आक्रमण अऊर मेटास्टेसिस (25-27) से जुड़ा अहै। टीएमई मा टी कोशिका मा एमएनए के स्रोत का बेहतर ढंग से समझै के लिए, हमने तीन एचजीएससी रोगियन (तालिका एस 5) के जलोदर अऊर ट्यूमर मा कोशिका प्रकारन मा एनएनएमटी के अभिव्यक्ति का चिह्नित करै के लिए एससीआरएनए-सेक का उपयोग किहिन। लगभग 6,500 कोशिका के विश्लेषण से पता चला कि जलोदर अऊर ट्यूमर वातावरण मा, एनएनएमटी अभिव्यक्ति अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट अऊर ट्यूमर कोशिका आबादी तक सीमित रही (चित्र 3, सी अऊर डी)। ई ध्यान देय लायक है कि कौनो भी आबादी मा कौनो स्पष्ट एनएनएमटी अभिव्यक्ति नाहीं है जवन पीटीपीआरसी (सीडी 45 +) (चित्र 3 डी अऊर चित्र एस 5 ए) का व्यक्त करत है, जवन इंगित करत है कि चयापचय स्पेक्ट्रम मा पावा गा एमएनए टी कोशिका मा पेश कीन गा है। एल्डिहाइड ऑक्सीडेज 1 (AOX1) के अभिव्यक्ति एमएनए का 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-पीवाईआर) या 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4-पीवाईआर) मा बदल देत है; चित्र 3B) COL1A1 (चित्र S5A) का व्यक्त करै वाले फाइब्रोब्लास्ट के आबादी तक भी सीमित है, जवन एक साथ इंगित करत है कि टी कोशिका मा पारंपरिक एमएनए चयापचय के क्षमता के कमी है। इन एमएनए-संबंधित जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का एचजीएससी रोगियन से जलोदर से दूसर स्वतंत्र कोशिका डेटा सेट का उपयोग कइके सत्यापित कीन गा रहा (चित्र एस 5 बी; एन = 6) (16)। यहिके अलावा, एमएनए से इलाज कीन गा स्वस्थ दाता टी कोशिका के मात्रात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (क्यूपीसीआर) विश्लेषण से पता चला कि नियंत्रण एसके-ओवी-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिका के तुलना मा, एनएनएमटी या एओएक्स 1 लगभग व्यक्त नाहीं कीन गा रहा (चित्र 3 ई)। ई अप्रत्याशित परिणाम बतावत हैं कि एमएनए फाइब्रोब्लास्ट या ट्यूमर से टीएमई मा आसन्न टी कोशिका मा स्रावित कीन जा सकत है।
यद्यपि उम्मीदवारन मा घुलनशील वाहक 22 (एसएलसी22) परिवार (एसएलसी22ए1, एसएलसी22ए2 अऊर एसएलसी22ए3) द्वारा एन्कोड कीन गा कार्बनिक कैटियन ट्रांसपोर्टर 1 से 3 (ओसीटी1, ओसीटी2 अऊर ओसीटी3) के परिवार शामिल है, लेकिन एमएनए के संभावित ट्रांसपोर्टर अबहियों अपरिभाषित हैं (28) । स्वस्थ दाता टी कोशिका से एमआरएनए के क्यूपीसीआर मा एसएलसी22ए1 के कम अभिव्यक्ति स्तर देखा गा लेकिन एसएलसी22ए2 के अज्ञात स्तर देखा गा, जेहिसे पुष्टि भै कि ई पहिले साहित्य मा रिपोर्ट कीन गा रहा (चित्र 3एफ) (29)। यहिके विपरीत, एसके-ओवी-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर सेल लाइन दुइनौ ट्रांसपोर्टरन के उच्च स्तर व्यक्त करत है (चित्र 3एफ)।
विदेशी एमएनए का अवशोषित करै के क्षमता रखै वाले टी कोशिका के संभावना का परीक्षण करै के खातिर, स्वस्थ दाता टी कोशिका का एमएनए के अलग-अलग सांद्रता के उपस्थिति मा 72 घंटा तक संवर्धित कीन गा रहा। बहिर्जात एमएनए के अभाव मा, एमएनए के सेलुलर सामग्री का पता नाहीं लगावा जा सकत है (चित्र 3 जी)। हालांकि, बहिर्जात एमएनए के साथ इलाज कीन गा सक्रिय टी कोशिका कोशिका मा एमएनए सामग्री मा खुराक-निर्भर वृद्धि देखाइन, 6 एमएम एमएनए (चित्र 3 जी) तक। ई परिणाम बतावत है कि ट्रांसपोर्टर अभिव्यक्ति के निम्न स्तर अऊर इंट्रासेल्युलर एमएनए चयापचय के लिए जिम्मेदार मुख्य एंजाइम के कमी के बावजूद, टीआईएल अभी भी एमएनए ले सकत है।
रोगियन के टी कोशिका अऊर इन विट्रो एमएनए अवशोषण प्रयोगन मा चयापचय के स्पेक्ट्रम ई संभावना का बढ़ावत है कि कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट (सीएएफ) एमएनए का स्राव करत हैं अऊर ट्यूमर कोशिका टीआईएल के फेनोटाइप अऊर कार्य का नियंत्रित कर सकत हैं। टी कोशिका पर एमएनए के प्रभाव का निर्धारित करै के लिए, स्वस्थ दाता टी कोशिका का एमएनए के उपस्थिति या अनुपस्थिति मा इन विट्रो मा सक्रिय कीन गा रहा, अऊर ओनके प्रसार अऊर साइटोकाइन उत्पादन का मूल्यांकन कीन गा रहा। सबसे अधिक खुराक मा एमएनए जोड़ै के 7 दिन बाद, जनसंख्या दोगुना होय के संख्या मामूली रूप से कम होइ गै, जबकि सब खुराक मा जोश बना रहा (चित्र 4 ए)। यहिके अलावा, बहिर्जात एमएनए के उपचार के परिणामस्वरूप ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (टीएनएफα; चित्र 4 बी) का व्यक्त करै वाली सीडी 4 + अऊर सीडी 8 + टी कोशिका के अनुपात मा वृद्धि भै। यहिके विपरीत, सीडी 4 + टी कोशिका मा आईएफएन-γ का इंट्रासेल्युलर उत्पादन काफी कम होइ गवा रहा, लेकिन सीडी 8 + टी कोशिका मा नाहीं, अऊर इंटरल्यूकिन 2 (आईएल-2; चित्र 4, सी अऊर डी) मा कौनो महत्वपूर्ण बदलाव नाहीं रहा। यहिसे, इन एमएनए-उपचारित टी सेल संस्कृतियन से सुपरनेटेंट के एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) मा टीएनएफα मा महत्वपूर्ण वृद्धि, आईएफएन-γ मा कमी अऊर आईएल-2 मा कौनो बदलाव नाहीं देखा गा (चित्र 4, ई से जी)। . आईएफएन-γ के कमी से पता चलत है कि एमएनए टी कोशिका के एंटी-ट्यूमर गतिविधि का रोकै मा भूमिका निभा सकत है। टी सेल-मध्यस्थता साइटोटॉक्सिसिटी पर एमएनए के प्रभाव का अनुकरण करै के खातिर, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) -सीएआर-टी) कोशिका द्वारा विनियमित फोलेट रिसेप्टर α अऊर सीएआर-टी (जीएफपी) का लक्ष्य बनावै वाले काइमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी (एफआरα-सीएआर-टी) कोशिका स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिका (पीबीएमसी) द्वारा उत्पादित कीन जात हैं। सीएआर-टी कोशिका का एमएनए के उपस्थिति मा 24 घंटा तक संवर्धित कीन गा रहा, अऊर फिर मानव एसके-ओवी-3 डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिका के साथ सह-संवर्धित कीन गा रहा जवन फोलेट रिसेप्टर α का 10:1 के प्रभावक से लक्ष्य अनुपात मा व्यक्त करत रहा। एमएनए उपचार के परिणामस्वरूप एफआरα-सीएआर-टी कोशिका के हत्या गतिविधि मा महत्वपूर्ण कमी आई, जवन एडेनोसिन (चित्र 4 एच) से इलाज कीन गा एफआरα-सीएआर-टी कोशिका के समान रहा।
(ए) कुल व्यवहार्य कोशिका गिनती अऊर जनसंख्या दोगुना (पीडी) सीधे दिन 7 पर संस्कृति से। बार ग्राफ छह स्वस्थ दाताओं के औसत + एसईएम का प्रतिनिधित्व करत है। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगन से डेटा का प्रतिनिधित्व करत है। (बी से डी) सीडी 3/सीडी 28 अऊर आईएल -2 का उपयोग 7 दिन तक उनके संबंधित एमएनए सांद्रता मा टी कोशिका का सक्रिय करै के लिए कीन गा रहा। विश्लेषण से पहिले, कोशिका का 4 घंटा के लिए गोल्जीस्टॉप के साथ पीएमए/आयोनोमाइसिन से उत्तेजित कीन गा रहा। टी कोशिका मा टीएनएफα (बी) अभिव्यक्ति। जीवित कोशिका मा TNFα अभिव्यक्ति के उदाहरण छवि (बाएं) अऊर सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। टी कोशिका मा आईएफएन-γ (सी) अऊर आईएल-2 (डी) अभिव्यक्ति। साइटोकाइन के अभिव्यक्ति का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मापा गा रहा। बार ग्राफ औसत (n = 6 स्वस्थ दाता) + SEM का प्रतिनिधित्व करत है। पी मान का निर्धारित करै के लिए भिन्नता अऊर दोहराए गए माप (* पी <0.05 अऊर ** पी <0.01) के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग करा। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगन से डेटा का प्रतिनिधित्व करत है। (ई से जी) सीडी 3/सीडी 28 अऊर आईएल -2 का उपयोग 7 दिन तक उनके संबंधित एमएनए सांद्रता मा टी कोशिका का सक्रिय करै के लिए कीन गा रहा। पीएमए/आयोनोमाइसिन उत्तेजना के 4 घंटे से पहिले अऊर बाद मा माध्यम एकत्र कीन गा रहा। टीएनएफα (ई), आईएफएन-γ (एफ) अऊर आईएल-2 (जी) के सांद्रता का एलिसा द्वारा मापा गा रहा। बार ग्राफ औसत (n = 5 स्वस्थ दाता) + SEM का प्रतिनिधित्व करत है। भिन्नता अऊर दोहराए गए माप (* पी <0.05) के एकतरफा विश्लेषण का उपयोग कइके पी मान निर्धारित कीन गा है। बिंदीदार रेखा पता लगावै के पता लगावै के सीमा का इंगित करत है। (एच) कोशिका विघटन परख। FRα-CAR-T या GFP-CAR-T कोशिकाओं का 24 घंटे के लिए एडेनोसिन (250μM) या MNA (10 mM) के साथ समायोजित कीन गा रहा, या अनुपचारित छोड़ दीन गा रहा (Ctrl)। एसके-ओवी-3 कोशिका के प्रतिशत हत्या का मापा गा रहा। वेल्च टी टेस्ट (* पी <0.5 अऊर ** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान।
एमएनए-निर्भर टीएनएफα अभिव्यक्ति विनियमन के यंत्रवत समझ प्राप्त करै के खातिर, एमएनए-उपचारित टी कोशिका के टीएनएफα एमआरएनए मा बदलाव का मूल्यांकन कीन गा रहा (चित्र 5 ए)। एमएनए से इलाज कीन गा स्वस्थ दाता टी कोशिका टीएनएफα प्रतिलेखन स्तर मा दुगुना वृद्धि देखाइन, जेसे पता चलत है कि एमएनए टीएनएफα प्रतिलेखन विनियमन पर निर्भर है। यहि संभावित नियामक तंत्र के जांच करै के ताईं, TNFα का नियंत्रित करै वाले दुई ज्ञात प्रतिलेखन कारक, अर्थात् सक्रिय टी सेल न्यूक्लियर फैक्टर (NFAT) अऊर विशिष्ट प्रोटीन 1 (Sp1), समीपस्थ TNFα प्रमोटर ( 30) से एमएनए बाइंडिंग के जवाब मा मूल्यांकन कीन गा रहा। टीएनएफα प्रमोटर मा 6 पहचाने गए एनएफएटी बाइंडिंग साइट अऊर 2 एसपी 1 बाइंडिंग साइट होत हैं, जवन एक साइट [5'कैप से -55 बेस पेयर (बीपी)] (30) पर ओवरलैप करत हैं। क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (चिप) से पता चला कि जब एमएनए के साथ इलाज कीन जात है, तौ टीएनएफα प्रमोटर से एसपी 1 का बंधन तीन गुना बढ़ जात है। एनएफएटी का समावेश भी बढ़ गवा अऊर महत्व के पास पहुँचा (चित्र 5 बी)। ई आंकड़ा बतावत हैं कि एमएनए एसपी 1 प्रतिलेखन के माध्यम से टीएनएफα के अभिव्यक्ति का नियंत्रित करत है, अऊर कम हद तक एनएफएटी के अभिव्यक्ति का।
(A) एमएनए के बिना संवर्धित टी कोशिका के तुलना मा, एमएनए के साथ इलाज कीन गे टी कोशिका मा टीएनएफα अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावा गा है (n = 5 स्वस्थ दाता)। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगन से डेटा का प्रतिनिधित्व करत है। (बी) एनएफएटी अऊर एसपी 1 के बाद 8 एमएम एमएनए के साथ या बिना इलाज कीन गा टी कोशिका के टीएनएफα प्रमोटर का 4 घंटे के लिए (सीटीआरएल) अऊर पीएमए / आयनोमाइसिन उत्तेजना के साथ जोड़ा गा रहा। इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) अऊर एच 3 का क्रमशः इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए नकारात्मक अऊर सकारात्मक नियंत्रण के रूप मा उपयोग कीन गा रहा। चिप के मात्रा निर्धारण से पता चला कि एमएनए-उपचारित कोशिका मा टीएनएफα प्रमोटर से एसपी 1 अऊर एनएफएटी के बंधन नियंत्रण के तुलना मा कई बार बढ़ गवा। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोगन से डेटा का प्रतिनिधित्व करत है। कई टी-टेस्ट (*** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान। (सी) एचजीएससी के जलोदर के तुलना मा, टी कोशिका (गैर-साइटोटॉक्सिक) ट्यूमर मा टीएनएफ के अभिव्यक्ति मा वृद्धि देखाइन। रंग अलग-अलग मरीजन का प्रतिनिधित्व करत हैं। प्रदर्शित कोशिकाओं का यादृच्छिक रूप से 300 तक नमूना लिया गा है अऊर ओवरड्राइंग (** Padj = 0.0076) का सीमित करै के लिए जिटर कीन गा है। (डी) डिम्बग्रंथि कैंसर के लिए एमएनए का प्रस्तावित मॉडल। एमएनए ट्यूमर कोशिका अऊर टीएमई मा फाइब्रोब्लास्ट मा पैदा होत है अऊर टी कोशिका द्वारा लीन जात है। एमएनए टीएनएफα प्रमोटर से एसपी 1 के बंधन का बढ़ावत है, जेहिसे टीएनएफα प्रतिलेखन अऊर टीएनएफα साइटोकाइन उत्पादन मा वृद्धि होत है। एमएनए आईएफएन-γ मा भी कमी का कारण बनत है। टी सेल फंक्शन के निषेध से मारय के क्षमता कम होइ जात है अऊर ट्यूमर के विकास तेज होइ जात है।
रिपोर्ट के अनुसार, TNFα मा आगे अऊर पीछे-निर्भर एंटी-ट्यूमर अऊर एंटी-ट्यूमर प्रभाव होत हैं, लेकिन डिम्बग्रंथि कैंसर के विकास अऊर मेटास्टेसिस का बढ़ावा देय मा एकर एक प्रसिद्ध भूमिका है (31-33)। रिपोर्ट के अनुसार, डिम्बग्रंथि कैंसर के मरीजन मा जलोदर अऊर ट्यूमर ऊतकों मा TNFα के सांद्रता सौम्य ऊतकों (34-36) के तुलना मा अधिक है। तंत्र के संदर्भ मा, टीएनएफα सफेद रक्त कोशिका के सक्रियण, कार्य अऊर प्रसार का नियंत्रित कइ सकत है, अऊर कैंसर कोशिका के फेनोटाइप का बदल सकत है (37, 38)। इन निष्कर्षन के अनुरूप, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला कि टीएनएफ जलोदर (चित्र 5सी) के तुलना मा ट्यूमर ऊतकों मा टी कोशिका मा काफी अप-रेगुलेट कीन गा रहा। टीएनएफ अभिव्यक्ति मा वृद्धि केवल एक गैर-साइटोटॉक्सिक फेनोटाइप (चित्र एस 5 ए) के साथ टी सेल आबादी मा स्पष्ट रही। संक्षेप मा, ई डेटा ई विचार का समर्थन करत है कि एमएनए के एचजीएससी मा दोहरे इम्यूनोसप्रेसिव अऊर ट्यूमर बढ़ावा देय वाले प्रभाव हैं।
फ्लो साइटोमेट्री के आधार पर फ्लोरोसेंट लेबलिंग टीआईएल चयापचय के अध्ययन करै के लिए मुख्य विधि बन गै है। इन अध्ययनन से पता चला है कि परिधीय रक्त लिम्फोसाइट या द्वितीयक लिम्फोइड अंगन से टी कोशिका के तुलना मा, मूरिन अऊर मानव टीआईएल मा ग्लूकोज (4, 39) अऊर माइटोकॉन्ड्रियल कार्य के धीरे-धीरे नुकसान (19, 40) के अवशोषण के उच्च प्रवृत्ति होत है। यद्यपि हमने यहि अध्ययन मा समान परिणाम देखे हैं, लेकिन प्रमुख विकास एकै कटा हुआ ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर कोशिका अऊर टीआईएल के चयापचय के तुलना करब है। इनमा से कुछ पिछली रिपोर्टन के अनुरूप, जलोदर अऊर ट्यूमर से ट्यूमर (सीडी 45-ईपीसीएएम +) कोशिका मा सीडी 8 + अऊर सीडी 4 + टी कोशिका के तुलना मा उच्च ग्लूकोज अवशोषण होत है, जेसे पता चलत है कि ट्यूमर कोशिका के उच्च ग्लूकोज अवशोषण के तुलना टी कोशिका से कीन जा सकत है। टी सेल प्रतियोगिता के अवधारणा। टीएमई। हालांकि, ट्यूमर कोशिका के माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिका के तुलना मा अधिक है, लेकिन माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिका के समान है। ई परिणाम उभरत विषय का पुष्ट करत हैं कि ऑक्सीडेटिव चयापचय ट्यूमर कोशिका (41, 42) के लिए महत्वपूर्ण है। उइ इ भी सुझाव देत हैं कि सीडी 8 + टी कोशिका सीडी 4 + टी कोशिका के तुलना मा ऑक्सीडेटिव शिथिलता के प्रति अधिक संवेदनशील होइ सकत हैं, या सीडी 4 + टी कोशिका माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि का बनाए रखै के लिए ग्लूकोज के अलावा कार्बन स्रोतन का उपयोग कर सकत हैं (43, 44)। ई ध्यान दिया जाय कि हम जलोदर मा सीडी 4 + टी प्रभावक, टी प्रभावक मेमोरी अऊर टी केंद्रीय मेमोरी कोशिका के बीच ग्लूकोज अपटेक या माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि मा कौनो अंतर नाहीं देखेन। इसी तरह, ट्यूमर मा सीडी 8 + टी कोशिका के भेदभाव स्थिति का ग्लूकोज अवशोषण मा बदलाव से कौनो लेना-देना नाहीं है, जवन इन विट्रो मा संवर्धित टी कोशिका अऊर विवो मा मानव टीआईएल के बीच महत्वपूर्ण अंतर का उजागर करत है (22)। ई अवलोकन निष्पक्ष स्वचालित कोशिका जनसंख्या आवंटन के उपयोग से भी पुष्टि कीन गा रहें, जेहिसे आगे पता चला कि ट्यूमर कोशिका के तुलना मा उच्च ग्लूकोज अवशोषण अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि वाले CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + कोशिका प्रचलित हैं लेकिन चयापचय सक्रिय कोशिका आबादी है। ई आबादी scRNA-seq विश्लेषण मा पहचाने गए मायलोइड दमनकारी कोशिका या प्लाज्मासाइटोइड डेंड्रिटिक कोशिका के पुटेटिव उप-जनसंख्या का प्रतिनिधित्व कर सकत है। यद्यपि इन दुइनौ का मानव डिम्बग्रंथि ट्यूमर [45] मा रिपोर्ट कीन गा है, लेकिन ओनका अबहियों जरूरत है आगे के काम ई मायलोइड उप-जनसंख्या का वर्णन करै के है।
यद्यपि प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि कोशिका प्रकारन के बीच ग्लूकोज अऊर ऑक्सीडेटिव चयापचय मा सामान्य अंतर का स्पष्ट कइ सकत हैं, टीएमई मा माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय के लिए ग्लूकोज या अन्य कार्बन स्रोतन द्वारा उत्पादित सटीक चयापचय अभी तक निर्धारित नाहीं कीन गा हैं। कौनो दिहल गै टीआईएल सबसेट मा चयापचय के उपस्थिति या अनुपस्थिति का असाइन करै के लिए काटे गए ऊतक से कोशिका आबादी के शुद्धिकरण के आवश्यकता होत है। यहिसे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलके हमार कोशिका संवर्धन विधि उन चयापचयों मा अंतर्दृष्टि प्रदान कइ सकत है जवन रोगी के नमूना के मिलान मा टी कोशिका अऊर ट्यूमर कोशिका आबादी मा अलग-अलग समृद्ध होत हैं। यद्यपि ई विधि मा प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छँटाई के तुलना मा फायदा है, कुछ चयापचय पुस्तकालय अंतर्निहित स्थिरता अऊर/या तेजी से कारोबार दर (22) के कारण प्रभावित होइ सकत हैं। फिर भी, हमार विधि दुई मान्यता प्राप्त इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स, एडेनोसिन अऊर काइनुरेनिन के पहचान करै में सक्षम रही, काहे से कि उ नमूना प्रकारन के बीच बहुत भिन्न होत हैं।
ट्यूमर अऊर टीआईएल उपप्रकारन के हमार मेटाबोनोमिक विश्लेषण डिम्बग्रंथि टीएमई मा चयापचय के भूमिका के बारे मा अउर जानकारी प्रदान करत है। सबसे पहिले, प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करत हुए, हम निर्धारित किहिन कि ट्यूमर अऊर सीडी 4 + टी कोशिका के बीच माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि मा कौनो अंतर नाहीं रहा। हालांकि, एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण से इन आबादी के बीच चयापचय के बहुतायत मा महत्वपूर्ण बदलाव पता चला, जेसे पता चलत है कि टीआईएल चयापचय अऊर ओकर समग्र चयापचय गतिविधि के बारे मा निष्कर्ष निकालै के लिए सावधानीपूर्वक व्याख्या के आवश्यकता होत है। दूसर बात, एमएनए ट्यूमर मा नाहीं, बल्कि जलोदर मा सीडी 45-कोशिका अऊर टी कोशिका के बीच सबसे बड़ा अंतर वाला चयापचय है। यहिसे, कम्पार्टमेंटलाइजेशन अऊर ट्यूमर स्थान के टीआईएल चयापचय पर अलग-अलग प्रभाव पड़ सकत हैं, जवन कि कौनो सूक्ष्म पर्यावरण मा संभावित विषमता का उजागर करत है। तीसरा, एमएनए-उत्पादक एंजाइम एनएनएमटी के अभिव्यक्ति मुख्य रूप से सीएएफ तक सीमित है, जवन कम हद तक ट्यूमर कोशिका है, लेकिन ट्यूमर-व्युत्पन्न टी कोशिका मा पता लगावै योग्य एमएनए स्तर देखल जात है। डिम्बग्रंथि सीएएफ मा एनएनएमटी के अतिप्रवाह का एक ज्ञात कैंसर-प्रोत्साहन प्रभाव है, आंशिक रूप से सीएएफ चयापचय, ट्यूमर आक्रमण अऊर मेटास्टेसिस (27) के बढ़ावा के कारण। यद्यपि टीआईएल का समग्र स्तर मध्यम है, सीएएफ मा एनएनएमटी के अभिव्यक्ति कैंसर जीनोम एटलस (टीसीजीए) मेसेन्चाइमल उपप्रकार से निकटता से संबंधित है, जवन खराब रोग का निदान (27, 46, 47) से जुड़ा अहै। अंत मा, एमएनए क्षरण के लिए जिम्मेदार एंजाइम एओएक्स 1 के अभिव्यक्ति भी सीएएफ आबादी तक सीमित है, जवन इंगित करत है कि टी कोशिका मा एमएनए का चयापचय करै के क्षमता नाहीं है। ई परिणाम ई विचार का समर्थन करत हैं कि यद्यपि ई खोज का सत्यापित करै के लिए आगे के काम के जरूरत है, टी कोशिका मा एमएनए के उच्च स्तर एक प्रतिरक्षा दमनकारी सीएएफ सूक्ष्म पर्यावरण के उपस्थिति का इंगित कर सकत है।
एमएनए ट्रांसपोर्टर के निम्न अभिव्यक्ति स्तर अऊर एमएनए चयापचय मा शामिल प्रमुख प्रोटीन के अज्ञात स्तर का देखत हुए, टी कोशिका मा एमएनए के उपस्थिति अप्रत्याशित है। न तौ एनएनएमटी अऊर न ही एओएक्स 1 का scRNA-seq विश्लेषण अऊर दुई स्वतंत्र समूहन के लक्षित qPCR द्वारा पता लगावा जा सकत रहा। ई परिणाम बतावत हैं कि एमएनए टी कोशिका द्वारा संश्लेषित नाहीं कीन जात है, बल्कि आसपास के टीएमई से अवशोषित कीन जात है। इन विट्रो प्रयोग से पता चलत है कि टी कोशिका बहिर्जात एमएनए जमा करत हैं।
हमार इन विट्रो अध्ययन से पता चला है कि बहिर्जात एमएनए टी कोशिका मा टीएनएफα के अभिव्यक्ति का प्रेरित करत है अऊर टीएनएफα प्रमोटर से एसपी 1 के बंधन का बढ़ावत है। यद्यपि टीएनएफα मा एंटी-ट्यूमर अऊर एंटी-ट्यूमर दुनौ कार्य होत हैं, लेकिन डिम्बग्रंथि कैंसर मा, टीएनएफα डिम्बग्रंथि कैंसर के विकास का बढ़ावा दे सकत है (31-33)। डिम्बग्रंथि ट्यूमर सेल कल्चर मा TNFα का बेअसर करब या माउस मॉडल मा TNFα सिग्नल का उन्मूलन TNFα-मध्यस्थता भड़काऊ साइटोकाइन उत्पादन मा सुधार कइ सकत है अऊर ट्यूमर के विकास का रोक सकत है (32, 35)। यहिसे, यहि मामला मा, टीएमई-व्युत्पन्न एमएनए ऑटोक्राइन लूप के माध्यम से टीएनएफα-निर्भर तंत्र के माध्यम से एक प्रो-इंफ्लेमेटरी चयापचय के रूप मा काम कर सकत है, जेहिसे डिम्बग्रंथि कैंसर के घटना अऊर प्रसार का बढ़ावा मिलत है (31)। यहि संभावना के आधार पर, TNFα नाकाबंदी का डिम्बग्रंथि कैंसर (37, 48, 49) के लिए एक संभावित चिकित्सीय एजेंट के रूप मा अध्ययन कीन जात है। यहिके अलावा, एमएनए डिम्बग्रंथि ट्यूमर कोशिका के लिए सीएआर-टी कोशिका के साइटोटॉक्सिसिटी का बिगाड़त है, जे एमएनए-मध्यस्थता प्रतिरक्षा दमन के लिए अउर साक्ष्य प्रदान करत है। सामूहिक रूप से, ई परिणाम एक मॉडल का सुझाव देत हैं जेहिमा ट्यूमर अऊर सीएएफ कोशिका बाह्य कोशिकीय टीएमई मा एमएनए का स्राव करत हैं। (i) टीएनएफ-प्रेरित डिम्बग्रंथि कैंसर वृद्धि उत्तेजना अऊर (ii) एमएनए-प्रेरित टी सेल साइटोटॉक्सिक गतिविधि निषेध के माध्यम से, ई एक दोहरा ट्यूमर प्रभाव हो सकत है (चित्र 5डी)।
निष्कर्ष के तौर पर, तेजी से कोशिका संवर्धन, एकल-कोशिका अनुक्रमण अऊर चयापचय प्रोफाइलिंग के संयोजन का लागू कइके, ई अध्ययन एचजीएससी रोगियन मा ट्यूमर अऊर जलोदर कोशिका के बीच बहुत बड़ा इम्यूनोमेटाबोलोमिक अंतर का पता लगाइस। ई व्यापक विश्लेषण से पता चला कि टी कोशिका के बीच ग्लूकोज अवशोषण अऊर माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधि मा अंतर है, अऊर एमएनए का एक गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा नियामक चयापचय के रूप मा पहचाना गा है। ई डेटा का प्रभाव पड़त है कि टीएमई मानव कैंसर मा टी सेल चयापचय का कैसे प्रभावित करत है। यद्यपि टी कोशिका अऊर कैंसर कोशिका के बीच पोषक तत्वन के लिए सीधा प्रतिस्पर्धा बतावा गा है, चयापचय ट्यूमर प्रगति का बढ़ावा देय अऊर संभवतः अंतर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का दबावै के लिए अप्रत्यक्ष नियामक के रूप मा भी काम कर सकत हैं। इन नियामक चयापचयों के कार्यात्मक भूमिका का आगे का विवरण एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का बढ़ावै के लिए वैकल्पिक रणनीतियन का खोल सकत है।
रोगी के नमूना अऊर नैदानिक ​​डेटा कनाडाई ऊतक भंडार नेटवर्क द्वारा प्रमाणित बीसी कैंसर ट्यूमर ऊतक भंडार के माध्यम से प्राप्त कीन गा रहें। बीसी कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी अऊर यूनिवर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया (एच07-00463) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार, सब मरीजन के नमूना अऊर नैदानिक ​​डेटा सूचित लिखित सहमति प्राप्त किहिन या औपचारिक रूप से ओनके सहमति माफ करिन। नमूना प्रमाणित बायोबैंक (बीआरसी-00290) मा संग्रहीत कीन जात हैं। विस्तृत रोगी विशेषता तालिका S1 अऊर S5 मा देखावा गा है। क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए, एक स्केलपेल का उपयोग रोगी के ट्यूमर नमूना का यांत्रिक रूप से विघटित करै के लिए कीन जात है अऊर फिर एकल कोशिका निलंबन प्राप्त करै के लिए 100-माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से धकेल दीन जात है। कोशिकाओं का गोली बनावै अऊर सुपरनेटेंट का हटावै के लिए रोगी के जलोदर का 1500 आरपीएम पर 4°C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। ट्यूमर अऊर जलोदर से प्राप्त कोशिका 50% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 40% आरपीएमआई-1640 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) अऊर 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड मा क्रायोप्रिजर्व कीन गै रहीं। इन संरक्षित एकल कोशिका निलंबन का पिघलावा गा रहा अऊर नीचे वर्णित मेटाबोलोमिक्स अऊर चयापचय निर्धारण के लिए उपयोग कीन गा रहा।
पूरा माध्यम मा 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर 50:50 पूरक आरपीएमआई 1640: एआईएमवी होत है। आरपीएमआई 1640 + 2.05 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) 10% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 एमएम हेप्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ पूरक, x1 पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) घोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) अऊर 50 माइक्रोन एमबी-मर्कैप्टोइथेनॉल। एआईएमवी (इन्विट्रोजन) 20 एमएम हेप्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) अऊर 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ पूरक है। फ्लो साइटोमीटर धुंधला बफर मा 0.22μm फ़िल्टर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस; इन्विट्रोजन) 3% गर्मी-निष्क्रिय एबी मानव सीरम (सिग्मा) के साथ पूरक रहा। कोशिका संवर्धन बफर 0.22μm फ़िल्टर कीन गा पीबीएस से बना अहै अऊर 0.5% गर्मी-निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ पूरक अहै।
37°C पूर्ण माध्यम मा, कोशिका 30 मिनट के लिए 10 एनएम एमटी डीआर अऊर 100 माइक्रोन 2-एनबीडीजी से दाग दीन गै रहीं। अगला, कोशिका का 15 मिनट के लिए 4°C पर व्यवहार्यता डाई eF506 से दाग दीन गा रहा। एफसी ब्लॉक (ईबायोसाइंस) अऊर ब्रिलियंट स्टेन बफर (बीडी बायोसाइंसेज) मा कोशिका का फिर से निलंबित करा, फ्लो साइटोमीटर स्टेनिंग बफर (निर्माता के निर्देशन के अनुसार) मा पतला करा, अऊर कमरा के तापमान पर 10 मिनट तक ऊष्मायन करा। कोशिकाओं का 20 मिनट के लिए 4°C पर फ्लो साइटोमेट्री धुंधला बफर मा एंटीबॉडी (तालिका S2) के एक सेट से दाग दें। विश्लेषण से पहिले प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला बफर (साइटेक ऑरोरा; 3L-16V-14B-8R विन्यास) मा कोशिका का फिर से निलंबित करा। सेल काउंट डेटा का विश्लेषण करै के लिए स्पेक्ट्रोफ्लो अऊर फ्लोजो वी 10 का उपयोग करा, अऊर डेटा बनावै के लिए ग्राफपैड प्रिज्म 8 का उपयोग करा। 2-एनबीडीजी अऊर एमटी डीआर के औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का लॉग-सामान्यीकृत कीन गा रहा, अऊर फिर मिलान किहे गए मरीजन के हिसाब से सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक युग्मित टी परीक्षण का उपयोग कीन गा रहा। विश्लेषण से 40 से कम घटनाओं वाली सब आबादी का हटावा जाय; सांख्यिकीय विश्लेषण अऊर डेटा विज़ुअलाइज़ेशन करै से पहिले कौनो भी नकारात्मक मान के लिए 1 का एमएफआई मान दर्ज करा।
उपरोक्त प्रक्रिया पैनल के मैनुअल गेटिंग रणनीति का पूरक बनावै के खातिर, हमने फ्लोजो मा मृत कोशिका का खतम करै के बाद आबादी का स्वचालित रूप से कोशिका असाइन करै के लिए आकार प्रतिबंध वृक्ष (FAUST) (21) द्वारा पूर्ण एनोटेशन का उपयोग किहिन। हम मैन्युअल रूप से आउटपुट का प्रबंधित करत हैं ताकि आबादी का विलय कीन जा सके जवन गलत आवंटित (पीडी 1+ के साथ पीडी 1-ट्यूमर कोशिकाओं का संयोजन) अऊर आबादी का बनाए रखा जात है। हर नमूना मा कुल 11 आबादी के लिए औसतन 2% से अधिक कोशिका होत हैं।
ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादन (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) से पीबीएमसी का अलग करै के लिए फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग कीन गा रहा। सीडी 8 + टी कोशिकाओं का पीबीएमसी से सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) का उपयोग कइके अलग कीन गा रहा अऊर निर्माता के निर्देशन के अनुसार 2 सप्ताह के लिए ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) का उपयोग कइके पूरा माध्यम मा विस्तारित कीन गा रहा। कोशिकाओं का IL-7 (10 एनजी/एमएल; पेप्रोटेक) युक्त पूर्ण माध्यम मा 5 दिन तक खड़ा होवे के अनुमति दीन गै, अऊर फिर ट्रांसएक्ट के साथ फिर से उत्तेजित कीन गा। दिन 7 पर, निर्माता के निर्देशन के अनुसार, मानव सीडी 45 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) का उपयोग लगातार तीन दौरन मा कोशिकाओं का समृद्ध करै के लिए कीन गा रहा। कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (जैसा कि ऊपर वर्णित) के लिए विभाजित कीन गा रहा, अऊर एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए एक मिलियन कोशिका तीन बार विभाजित कीन गा रहा। नमूना नीचे वर्णित के अनुसार एलसी-एमएस/एमएस द्वारा संसाधित कीन गा रहें। हम 1,000 के आयन संख्या के साथ लापता चयापचय मान का अनुमान लगायेन। हर नमूना कुल आयन संख्या (टीआईसी) से सामान्यीकृत कीन जात है, लघुगणकीय रूप से परिवर्तित कीन जात है अऊर विश्लेषण से पहिले मेटाबोएनालिस्टआर मा स्वचालित रूप से सामान्यीकृत कीन जात है।
हर रोगी के एकल कोशिका निलंबन का पिघलावा गा रहा अऊर 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से पूरा माध्यम (जैसा कि ऊपर वर्णित) मा फ़िल्टर करा गा रहा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) का उपयोग कइके चुंबकीय बीड पृथक्करण द्वारा सकारात्मक चयन के तीन लगातार दौरन का उपयोग सीडी 8 +, सीडी 4 + अऊर सीडी 45- कोशिका (बर्फ पर) के लिए नमूना समृद्ध करै के लिए कीन गा रहा। संक्षेप मा, कोशिका कोशिका संवर्धन बफर (जैसा कि ऊपर वर्णित है) मा फिर से निलंबित कीन जात हैं अऊर गिना जात हैं। कोशिकाओं का मानव सीडी 8 मोती, मानव सीडी 4 मोती या मानव सीडी 45 मोती (मिल्टेनी) के साथ 4°C पर 15 मिनट के लिए ऊष्मायन करा गा रहा, अऊर फिर कोशिका संवर्धन बफर से धोवा गा रहा। नमूना एलएस कॉलम (मिल्टेनी) से गुजरत है, अऊर सकारात्मक अऊर नकारात्मक अंश एकत्रित कीन जात हैं। अवधि का कम करै अऊर कोशिका पुनर्प्राप्ति चरण का अधिकतम करै के खातिर, सीडी 8-अंश का तब सीडी 4+ संवर्धन के दूसर दौर के लिए उपयोग कीन जात है, अऊर सीडी 4-अंश का उपयोग बाद के सीडी 45-संवर्धन के लिए कीन जात है। पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान घोल का बर्फ पर रखौ।
चयापचय विश्लेषण के लिए नमूना तैयार करै के लिए, कोशिकाओं का एक बार बर्फ-ठंडा नमक के घोल से धोवा गा रहा, अऊर हर नमूना मा 80% मेथनॉल का 1 मिलीलीटर मिलावा गा रहा, फिर भंवर बनावा गा रहा अऊर तरल नाइट्रोजन मा स्नैप फ्रोजन कीन गा रहा। नमूना तीन फ्रीज-थॉ चक्रन के अधीन कीन गा अऊर 4°C पर 15 मिनट के लिए 14,000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा। चयापचय युक्त सुपरनेटेंट का सूखे तक वाष्पित कीन जात है। चयापचय पदार्थन का 0.03% फार्मिक एसिड के 50 μl मा फिर से घुलावा गा रहा, मिश्रण करै के लिए भंवर बनावा गा रहा, अऊर फिर मलबा का हटावै के लिए सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा।
ऊपर वर्णित के अनुसार चयापचय पदार्थन का निकालौ। मेटाबोलोमिक्स अनुसंधान के लिए सुपरनेटेंट का एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी बोतल मा स्थानांतरित करा। बैच प्रभावन का रोकै के लिए प्रत्येक नमूना का समान संख्या मा कोशिका के साथ इलाज करै के लिए एक यादृच्छिक उपचार प्रोटोकॉल का उपयोग करा। हमने एबी एससीआईएक्स क्यूटीआरएपी 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) पर पहिले प्रकाशित वैश्विक चयापचयों का गुणात्मक आकलन किहिन। मल्टीक्वांट संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स एससीआईएक्स) का उपयोग कइके क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण अऊर पीक एरिया एकीकरण कीन गा रहा।
लापता चयापचय मान का अनुमान लगावै के लिए 1000 के आयन गिनती का उपयोग कीन गा रहा, अऊर नमूना प्रसंस्करण से वाद्य विश्लेषण द्वारा पेश कीन गा बदलावन का सही करै के लिए प्रत्येक पता लगावा गा चयापचय के सामान्यीकृत शिखर क्षेत्र के गणना करै के लिए प्रत्येक नमूना के टीआईसी का उपयोग कीन गा रहा। टीआईसी के सामान्यीकरण के बाद, मेटाबोएनालिस्टआर (51) (डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) का उपयोग लघुगणकीय रूपांतरण अऊर स्वचालित मानक रेखा स्केलिंग के लिए कीन जात है। हम नमूना प्रकारन के बीच मेटाबोलोम अंतरन के खोजपूर्ण विश्लेषण करै के लिए शाकाहारी आर पैकेज के साथ पीसीए का उपयोग किहिन, अऊर रोगियन का विश्लेषण करै के लिए आंशिक अतिरेक विश्लेषण का उपयोग किहिन। नमूना के बीच यूक्लिडियन दूरी का क्लस्टर करै के लिए एक हीट मैप डेंड्रोग्राम बनावै के लिए वार्ड विधि का उपयोग करा। हम पूरे कोशिका प्रकार अऊर सूक्ष्म पर्यावरण मा विभिन्न रूप से प्रचुर मात्रा मा चयापचय के पहचान करै के लिए मानकीकृत चयापचय बहुतायत पर लिम्मा (52) का उपयोग किहिन। व्याख्या का सरल बनावै के खातिर, हम मॉडल का निर्दिष्ट करै के लिए समूह माध्य पैरामीटर का उपयोग करत हैं, अऊर सूक्ष्म पर्यावरण मा कोशिका प्रकारन का प्रत्येक समूह (n = 6 समूह) के रूप मा मानत हैं; महत्व परीक्षण के लिए, हमने प्रत्येक चयापचय के लिए तीन बार-बार माप किहिन गलत प्रतिकृति से बचे के खातिर, रोगी का लिम्मा डिजाइन मा एक बाधा के रूप मा शामिल कीन गा रहा। अलग-अलग मरीजन के बीच चयापचय मा अंतर के जाँच करै के खातिर, हम एक निश्चित तरीका से मरीजन का सहित लिम्मा मॉडल का समायोजित किहिन। हम कोशिका प्रकार अऊर पाडज <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार) के सूक्ष्म पर्यावरण के बीच पूर्व-निर्दिष्ट विपरीत के महत्व के रिपोर्ट करत हैं।
मिल्टेनी डेड सेल रिमूवल किट (>80% व्यवहार्यता) का उपयोग कइके जोर संवर्धन के बाद, 10x 5′जीन अभिव्यक्ति प्रोटोकॉल का उपयोग कइके कुल लाइव जमे हुए जलोदर अऊर ट्यूमर नमूना पर एकल-कोशिका प्रतिलेख अनुक्रमण कीन गा रहा। मिलान ट्यूमर अऊर जलोदर वाले पांच मामलन का विश्लेषण कीन गा रहा, हालांकि एक ट्यूमर नमूना से कम व्यवहार्यता ने एकर समावेश का रोका। रोगियन के कईयो चयन प्राप्त करै के खातिर, हम 10x क्रोमियम नियंत्रक के लेन मा हर रोगी के नमूना जोड़ेन, अऊर जलोदर अऊर ट्यूमर साइटन का अलग-अलग विश्लेषण किहिन। अनुक्रमण के बाद [इलुमिना हाईसेक 4000 28×98 बीपी पेयर एंड (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर अऊर जलोदर के लिए क्रमशः प्रति कोशिका 73,488 अऊर 41,378 रीड]], हमने सेलएसएनपी अऊर विरेओ (53) (सेलएसएनपी के आधार पर के रूप मा जीआरसीएच38 द्वारा प्रदान कीन गा आम मानव एसएनपी (वीसीएफ) का दाता पहचान सौंपा जात है। हम रोगी जीनोटाइप (आईबीएस) के निकटतम पहचान (आईबीएस) स्थिति का अनुमान लगावै के लिए एसएनपीरिलेट का उपयोग करत हैं डुप्लेक्स के रूप मा पहचाने गए अनअसाइन कोशिकाओं अऊर कोशिकाओं का छोड़ के जलोदर अऊर ट्यूमर नमूना (54) के बीच, हमने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए ट्यूमर अऊर जलोदर मा प्रचुर मात्रा मा कोशिका प्रतिनिधित्व वाले तीन मामलन का बरकरार रखिन। (क्रमशः ट्यूमर अऊर जलोदर से 4183 कोशिका) हम अभिव्यक्ति द्वारा क्लस्टर कोशिकाओं से जैकार्ड दूरी के आधार पर साझा निकटतम पड़ोसी नेटवर्क (एसएनएन) के लौवेन क्लस्टरिंग का उपयोग करत हैं। कोशिका सीडी 8 ए अऊर जीजेडएमए के अभिव्यक्ति से परिभाषित कीन जात हैं, कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति वाले उपसमूहन का छोड़ के हमने इज़ार एट अल (16) के प्रकाशित डेटा तक पहुँचा, जेहिमा ओनके टी-एसएनई एम्बेडिंग शामिल हैं, प्रतिरक्षा कोशिका मार्करन अऊर एनएनएमटी अभिव्यक्ति के बीच अभिव्यक्ति ओवरलैप का नियंत्रित कर सकत हैं।
पीबीएमसी का ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादन (स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज) से फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रण द्वारा अलग कीन गा रहा। सीडी 3 + कोशिका सीडी 3 मोती (मिल्टेनी) का उपयोग कइके पीबीएमसी से अलग कीन गै रहीं। एमएनए के उपस्थिति या अनुपस्थिति मा, सीडी 3+ कोशिका प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5 μg / एमएल), घुलनशील सीडी 28 (3 μg / एमएल) अऊर आईएल -2 (300 यू / एमएल; प्रोल्यूकिन) के साथ सक्रिय कीन जात रहीं। विस्तार के अंतिम दिन, व्यवहार्यता (फिक्सेबल वायबिलिटी डाई ईफ्लोर450, ईबायोसाइंस) अऊर प्रसार (123काउंट ईबीड्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा मूल्यांकन कीन गा रहा। घंटे के लिए गोल्जीस्टॉप के साथ पीएमए (20 एनजी / एमएल) अऊर आयनोमाइसिन (1 μg / एमएल) के साथ कोशिकाओं का उत्तेजित कइके प्रभावक कार्य का मूल्यांकन करा, अऊर सीडी 8-परसीपी (आरपीए-टी 8, बायोलेजेंड), सीडी 4-एएफ 700 (आरपीए-टी 4), बायोलेजेंड) अऊर टीएनएफα-फ्लोरोसिएंस आईसोथियन (टीसी एमए) (टीसी एमए 1) का निगरानी करा बीडी)। पीएमए (20 एनजी/एमएल) अऊर आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) के साथ 4 घंटा के लिए क्यूपीसीआर अऊर सीएचआईपी कोशिका का उत्तेजित करा। एलिसा सुपरनेटेंट का 4 घंटा के लिए पीएमए (20 एनजी/एमएल) अऊर आयनोमाइसिन (1 μg/ml) के साथ उत्तेजना से पहिले अऊर बाद मा एकत्र कीन गा रहा।
आरएनईजी प्लस मिनी किट (क्यूआईएजीईएन) का उपयोग कइके आरएनए का अलग करै के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करा। नमूना का समरूप बनावै के लिए QIAshredder (QIAGEN) का उपयोग करा। पूरक डीएनए (सीडीएनए) का संश्लेषण करै के लिए उच्च क्षमता वाले आरएनए से सीडीएनए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करा। निम्नलिखित जांच के साथ जीन अभिव्यक्ति (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) का मापने के लिए टैकमैन रैपिड एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करें: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs004275515111,112 एचएस02786624_जी1 [ग्लिसेराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट ऑफ हाइड्रोजन (जीएपीडीएच)] अऊर एचएस01010726_एम1 (एसएलसी22ए2)। नमूना माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिल्म के साथ माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम) मा स्टेपवनप्लस रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम) (एप्लाइड बायोसिस्टम) पर चलावा गा रहा। कौनो भी सीटी मान जवन 35 से अधिक होत है, ओका पता लगावै के सीमा से ऊपर माना जात है अऊर ओका पता लगावै लायक नाहीं माना जात है।
पहिले वर्णित (58) के अनुसार चिप का प्रदर्शन करा। संक्षेप मा, कोशिका का फॉर्मेल्डिहाइड (अंतिम सांद्रता 1.42%) से इलाज कीन गा रहा अऊर 10 मिनट के लिए कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा रहा। मिनट के लिए बर्फ पर पूरक सूजन बफर (25 एमएम हेपेस, 1.5 एमएम एमजीसीएल 2, 10 एमएम केसीएल अऊर 0.1% एनपी-40) का उपयोग करा, फिर वर्णित (58) के अनुसार इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर मा फिर से निलंबित करा। नमूना तब निम्नलिखित चक्रन के साथ सोनिकेट कीन गा रहा: 10 चक्र (20 1-सेकंड दाल) अऊर 40 सेकंड का स्थिर समय। रात भर 4°CC शेक पर नमूना के साथ चिप-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन जी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 1μl), हिस्टोन एच 3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl), एनएफएटी (इन्विट्रोजन; 3μl) अऊर एसपी1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl) एंटीबॉडी का ऊष्मायन करा। प्रोटीन ए मोती (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का नमूना के साथ 4°C पर 1 घंटा तक हल्का हिलावै के साथ ऊष्मायन करा, फिर डीएनए का समृद्ध करै के लिए चेलेक्स मोती (बायो-रेड) का उपयोग करा, अऊर प्रोटीन पाचन के लिए प्रोटीनेज के (थर्मो फिशर) का उपयोग करा। टीएनएफα प्रमोटर का पता पीसीआर द्वारा लगावा गा रहा: आगे, जीजीजी टीएटी सीसीटी टीजीए टीजीसी टीटीजी टीजीटी; एकरे विपरीत, जीटीजी सीसीए एसीए एक्ट जीसीसी टीटीटी एटीए टीजी (207-बीपी उत्पाद)। छवियन का इमेज लैब (बायो-रेड) द्वारा बनावा गा रहा अऊर इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग कइके मापा गा रहा।
कोशिका संवर्धन सुपरनेटेंट ऊपर वर्णित के अनुसार एकत्रित कीन गा रहा। मानव टीएनएफα एलिसा किट (इन्विट्रोजन), मानव आईएल-2 एलिसा किट (इन्विट्रोजन) अऊर मानव आईएफएन-γ एलिसा किट (एबीकैम) के निर्माता के प्रक्रिया के अनुसार निर्धारण कीन गा रहा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, TNFα अऊर IL-2 का पता लगावै के लिए सुपरनेटेंट का 1:100 अऊर IFN-γ का पता लगावै के लिए 1:3 पतला कीन गा रहा। 450 एनएम पर अवशोषण मापे के लिए एनविजन 2104 मल्टीलेबल रीडर (पर्किनएलमर) का उपयोग करा।
पीबीएमसी का ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादन (स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज) से फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रण द्वारा अलग कीन गा रहा। सीडी 3 + कोशिका सीडी 3 मोती (मिल्टेनी) का उपयोग कइके पीबीएमसी से अलग कीन गै रहीं। एमएनए के उपस्थिति या अनुपस्थिति मा, सीडी 3+ कोशिका प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5 μg / एमएल), घुलनशील सीडी 28 (3 μg / एमएल) अऊर आईएल -2 (300 यू / एमएल; प्रोल्यूकिन) के साथ 3 दिन के लिए सक्रिय कीन जात रहीं। दिन के बाद, कोशिका एकत्र कीन गै अऊर 0.9% खारा पानी से धोवा गा, अऊर गोली का जल्दी से जमवावा गा। कोशिका गिनती 123count eBeads का उपयोग कइके प्रवाह साइटोमेट्री (साइटेक ऑरोरा; 3L-16V-14B-8R कॉन्फ़िगरेशन) द्वारा कीन गै रही।
ऊपर वर्णित के अनुसार चयापचय पदार्थन का निकालौ। सूखे अर्क का 4000 सेल समकक्ष/μl के सांद्रता मा पुनर्गठित कीन गा रहा। रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) अऊर CORTECS T3 कॉलम (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) द्वारा नमूना का विश्लेषण करा। ध्रुवीय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर (6470, एजिलेंट), जेहिमा इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोड मा काम करत है। मोबाइल फेज ए 0.1% फार्मिक एसिड (H2O मा) है, मोबाइल फेज बी 90% एसीटोनाइट्रिल, 0.1% फार्मिक एसिड है। एलसी ढाल 100% ए के लिए 0 से 2 मिनट, 99% बी के लिए 2 से 7.1 मिनट अऊर 99% बी के लिए 7.1 से 8 मिनट है। फिर 3 मिनट के लिए 0.6 मिलीलीटर / मिनट के प्रवाह दर पर मोबाइल चरण ए के साथ कॉलम का फिर से संतुलित करा। . प्रवाह दर 0.4 मिलीलीटर/मिनट है, अऊर स्तंभ कक्ष का 50°C तक गरम कीन जात है। प्रतिधारण समय (आरटी) अऊर परिवर्तन (आरटी = 0.882 मिनट, परिवर्तन 1 = 137→94.1, परिवर्तन 2 = 137→92, रूपांतरण = 137→92, रूपांतरण = 137→87) स्थापित करै के लिए एमएनए के शुद्ध रासायनिक मानक (एम320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यॉर्क, ओंटारियो, कनाडा) का उपयोग करा। जब तीनौ संक्रमण सही अवधारण समय मा होत हैं, तौ विशिष्टता सुनिश्चित करै के लिए माप के लिए संक्रमण 1 का उपयोग कीन जात है। एमएनए (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) का मानक वक्र स्टॉक घोल (1 मिलीग्राम/एमएल) के छह सीरियल कमजोर पड़ने से क्रमशः 0.1, 1.0, 10 अऊर 100 एनजी/एमएल अऊर 1.0 अऊर 10μg/एमएल तरल के मानक प्राप्त करै के लिए उत्पन्न कीन गा रहा। पता लगावै के सीमा 1 एनजी/एमएल है, अऊर रैखिक प्रतिक्रिया 10 एनजी/एमएल अऊर 10μg/एमएल के बीच है। एलसी/एमएस विश्लेषण के लिए नमूना अऊर मानक के दुई माइक्रोलीटर के प्रत्येक इंजेक्शन का उपयोग कीन जात है, अऊर विश्लेषण मंच के स्थिरता सुनिश्चित करै के लिए हर आठ इंजेक्शन मा एक मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमूना चलावा जात है। सब एमएनए-उपचारित कोशिका नमूना के एमएनए प्रतिक्रिया परख के रैखिक सीमा के भीतर रहीं। डेटा विश्लेषण मासहंटर मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v9.0, एजिलेंट) का उपयोग कइके कीन गा रहा।
दूसर पीढ़ी के αFR-CAR निर्माण सोंग एट अल से लीन गा रहा। (59) संक्षेप मा, निर्माण मा निम्नलिखित सामग्री शामिल है: सीडी 8 ए लीडर अनुक्रम, मानव αएफआर-विशिष्ट एकल-श्रृंखला चर टुकड़ा, सीडी 8 ए काज अऊर ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, सीडी 27 इंट्रासेल्युलर डोमेन अऊर सीडी 3 जेड इंट्रासेल्युलर डोमेन। पूरा सीएआर अनुक्रम जेनस्क्रिप्ट द्वारा संश्लेषित कीन गा रहा, अऊर फिर संचरण दक्षता का मूल्यांकन करै के लिए उपयोग कीन जाय वाली जीएफपी अभिव्यक्ति कैसेट के अपस्ट्रीम दूसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल अभिव्यक्ति वेक्टर मा क्लोन कीन गा रहा।
लेंटिवायरस HEK293T कोशिकाओं के संक्रमण से बनावा जात है [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC); डुलबेको के संशोधित ईगल माध्यम मा उगावा जात है जेहिमा 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) अऊर 1% पेनस्ट्रेप होत है, अऊर सीएआर-जीएफपी वेक्टर का उपयोग करत है अऊर पैकेजिंग प्लास्मिड (पीएसपीएएक्स 2 अऊर पीएमडी 2.जी, एडजीन) लिपोफैक्शन अमीन (सिग्मा-एल्ड्रिच) का उपयोग करत है। वायरस युक्त सुपरनेटेंट का संक्रमण के 48 अऊर 72 घंटा बाद एकत्रित कीन गा रहा, फ़िल्टर कीन गा रहा अऊर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा केंद्रित कीन गा रहा। संचरण तक -80°C पर गाढ़ा वायरल सुपरनेटेंट का संग्रहीत करा।
पीबीएमसी का फिकोल ढाल घनत्व अपकेंद्रण द्वारा स्वस्थ दाता ल्यूकोसाइट पृथक्करण उत्पादन (स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज) से अलग कीन जात है। पीबीएमसी से सीडी 8+ कोशिका का अलग करै के लिए सकारात्मक चयन सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) का उपयोग करा। ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) के साथ अऊर टेक्समैक्स माध्यम [मिल्टेनी; 3% गर्मी-निष्क्रिय मानव सीरम, 1% पेनस्ट्रेप अऊर आईएल-2 (300 यू/एमएल) के साथ पूरक]। उत्तेजना के चौबीस घंटे बाद, टी कोशिकाओं का लेंटिवायरस (प्रति 106 कोशिकाओं में 10 μl केंद्रित वायरस सुपरनेटेंट) के साथ संचारित कीन गा रहा। साइटेक अरोरा (एफएससी (फॉरवर्ड स्कैटर)/एसएससी (साइड स्कैटर), सिंगलेट, जीएफपी+) पर संचरण के 1 से 3 दिन बाद, कम से कम 30% के संचरण दक्षता का प्रदर्शित करै के लिए कोशिकाओं के जीएफपी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करा।
सीएआर-टी कोशिकाओं का निम्नलिखित परिस्थितियन के तहत इम्यूनोकल्ट (स्टेमसेल टेक्नोलॉजीज; 1% पेनस्ट्रेप के साथ पूरक) मा 24 घंटे के लिए संवर्धित कीन गा रहा: अनुपचारित, 250 माइक्रोन एडेनोसिन या 10 एमएम एमएनए के साथ उपचारित। पूर्व उपचार के बाद, सीएआर-टी कोशिका का पीबीएस से धोवा गा अऊर 20,000 एसके-ओवी-3 कोशिका [एटीसीसी; मैकॉय 5 ए माध्यम (सिग्मा-एल्ड्रिच) मा 10% एफबीएस अऊर 1% पेनस्ट्रेप के साथ 10 पर पूरक: 1 के प्रभावक से लक्ष्य अनुपात का पूरक इम्यूनोकल्ट माध्यम मा तीन प्रति मा प्रवर्धित कीन गा रहा। एसके-ओवी-3 कोशिका अऊर डिजिटलिस सैपोनिन (0.5 मिलीग्राम/एमएल; सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ lysed SK-OV-3 कोशिका क्रमशः नकारात्मक अऊर सकारात्मक नियंत्रण के रूप मा उपयोग कीन गा रहें। सह-खेती के 24 घंटे के बाद, सुपरनेटेंट एकत्र कीन गा रहा अऊर निर्माता के निर्देशन (एलडीएच ग्लो साइटोटॉक्सिसिटी एसे किट, प्रोमेगा) के अनुसार लैक्टेट डिहाइड्रोजेनेज (एलडीएच) का मापा गा रहा। एलडीएच सुपरनेटेंट का एलडीएच बफर मा 1:50 पतला कीन गा रहा। हत्या का प्रतिशत निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कइके मापा गा रहा: हत्या का प्रतिशत = सुधार का प्रतिशत / अधिकतम हत्या दर x 100%, जहां सुधार का प्रतिशत = केवल सह-संस्कृति-टी कोशिका, अऊर अधिकतम हत्या दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण।
जइसे कि पाठ या सामग्री अऊर विधियन मा वर्णित अहै, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए ग्राफपैड प्रिज्म 8, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या आर v3.6.0 का उपयोग करा। यदि एकै रोगी (जैसे जलोदर अऊर ट्यूमर) से कईयो नमूना एकत्रित कीन जात हैं, तौ हम एक युग्मित टी परीक्षण का उपयोग करत हैं या उचित रूप से एक रैखिक या सामान्यीकृत मॉडल मा रोगी का यादृच्छिक प्रभाव के रूप मा शामिल करत हैं। मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण के लिए, महत्व परीक्षण तीन प्रति मा कीन जात है।
यहि लेख के लिए पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 देखौ
ई एक खुला पहुंच लेख है जवन क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लाइसेंस के शर्तन के तहत वितरित कीन जात है, जवन कौनो भी माध्यम मा उपयोग, वितरण अऊर पुनरुत्पादन के अनुमति देत है, जब तक कि अंतिम उपयोग व्यावसायिक लाभ के लिए न होय ​​अऊर आधार ई होय कि मूल काम सही होय। हवाला।
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मारिसा के. किलगौर (मारिसा के. किलगौर), सारा मैकफर्सन (सारा मैकफर्सन), लॉरेन जी. जकरियास (लॉरेन जी. जकारियास), अबीगैल एली एरिस जी. वाटसन (एच. वाटसन), जॉन स्टैग (जॉन स्टैग), ब्रैड एच. नेल्सन (ब्रैड एच. नेल्सन), राल्फ जे. डेफर्नी (आर. बेलार्डिनिस), जे. जोन्स (रसेल जी. जोन्स), फिनिस टी. हैमिल्टन (फिनिस टी.
एमएनए टी कोशिका के प्रतिरक्षा दमन मा योगदान देत है अऊर मानव कैंसर के इलाज के लिए एक संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य का प्रतिनिधित्व करत है।
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