कोशिका विभाजन अऊर होमियोस्टेसिस का बनाए रखै के लिए स्रावी मार्ग मा प्रोटीन छँटाई आवश्यक है। खोल-मध्यस्थता छँटाई के अलावा, स्रावी परिवहन के प्रक्रिया मा किनेसिन छँटाई मा लिपिड के भूमिका एक लंबा समय से चली आ रही बुनियादी प्रश्न है जेकर जवाब अबहीं तक नाहीं मिला है। हिंया, हम विवो मा साबित करै के लिए 3डी एक साथ बहुरंगी उच्च-रिज़ॉल्यूशन वास्तविक समय इमेजिंग करत हैं कि बहुत लंबा सेरामाइड लिपिड अंश के साथ नए संश्लेषित ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-अस्थिर प्रोटीन क्लस्टर अऊर विशेष एंडोप्लाज्म नेट एक्जिट साइट मा वर्गीकृत कीन जात हैं, जवन कि ट्रांसमेम्ब्रेन द्वारा उपयोग कीन जाय वाले प्रोटीन से अलग है। यहिके अलावा, हम देखावत हैं कि एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम झिल्ली मा सेरामाइड के श्रृंखला लंबाई यहि छँटाई चयनात्मकता के लिए महत्वपूर्ण है। हमार अध्ययन स्रावी मार्ग मा चयनात्मक निर्यात स्थलन मा लिपिड श्रृंखला लंबाई के आधार पर प्रोटीन कार्गो का वर्गीकृत करै के लिए पहिला प्रत्यक्ष इन विवो साक्ष्य प्रदान करत है।
यूकेरियोटिक कोशिका मा, एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम (ईआर) मा संश्लेषित प्रोटीन का तब उनके उचित कोशिकीय गंतव्य (1) तक वितरण के लिए स्रावी मार्ग के माध्यम से परिवहन के दौरान छाँटा जात है। कोट-मध्यस्थता छँटाई के अलावा, ई लंबे समय से अनुमान लगावा जात रहा कि कुछ लिपिड विशिष्ट प्रोटीन (2-5) के विशिष्ट झिल्ली डोमेन मा क्लस्टर कइके चयनात्मक निकास बिंदु के रूप मा भी काम कर सकत हैं। हालांकि, ई संभावित लिपिड-आधारित तंत्र का साबित करै के लिए अबहियों प्रत्यक्ष इन विवो साक्ष्य के कमी है। यहि बुनियादी समस्या का हल करै के खातिर, हम खमीर मा अध्ययन किहिन कि ग्लाइकोसिलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) लंगर प्रोटीन (जीपीआई-एपी) ईआर से अलग-अलग कैसे निर्यात कीन जात हैं। जीपीआई-एपी लिपिड-जुड़े कोशिका सतह प्रोटीन (6, 7) के एक किस्म हैं। जीपीआई-एपी एक स्रावित प्रोटीन है जवन ग्लाइकोलिपिड अंश (जीपीआई एंकर) के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक से जुड़ा होत है। उ ईआर लुमेन (8) मा रूढ़िवादी अनुवाद के बाद संशोधन के रूप मा जीपीआई एंकर का स्वीकार करत हैं। लगाव के बाद, जीपीआई-एपी ईआर से प्लाज्मा झिल्ली तक गोल्जी उपकरण (5, 9) से गुजरत है। जीपीआई एंकर के उपस्थिति से जीपीआई-एपी का स्रावी मार्ग (5, 9, 10) के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन (अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन सहित) से अलग-अलग परिवहन कीन जात है। खमीर कोशिका मा, जीपीआई-एपी एंडोप्लाज्मिक रेटिक्युलम मा अन्य स्रावित प्रोटीन से अलग कीन जात हैं, अऊर फिर कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (सीओपीआईआई) (6, 7) द्वारा लपेटे गए अद्वितीय पुटिकाओं मा पैक कीन जात हैं। ईआर निर्यात प्रक्रिया मा ई वर्गीकरण प्रक्रिया के निर्धारक अस्पष्ट हैं, लेकिन ई अनुमान लगावा जात है कि ई तंत्र के लिए लिपिड के आवश्यकता हो सकत है, खासकर जीपीआई एंकर (5, 8) के लिपिड भाग के संरचनात्मक पुनर्निर्माण। खमीर मा, जीपीआई लिपिड रीमॉडलिंग जीपीआई के संलग्न होए के तुरंत बाद शुरू होत है, अऊर कईयो मामलन मा, ई सेरामाइड का 26-कार्बन लंबी श्रृंखला संतृप्त फैटी एसिड (सी 26: 0) (11, 12) से बंधन का कारण बनत है। सी 26 सेरामाइड अब तक खमीर कोशिका द्वारा उत्पादित मुख्य सेरामाइड है। ई ईआर मा संश्लेषित कीन जात है अऊर एकर अधिकांश हिस्सा सीओपीआईआई पुटिकाओं (13) के माध्यम से गोल्जी तंत्र मा निर्यात कीन जात है। जीपीआई-एपी के ईआर निर्यात के लिए विशेष रूप से चलत सेरामाइड संश्लेषण (14, 15) के आवश्यकता होत है, अऊर बदले मा, गोल्जी तंत्र मा सेरामाइड का इनोसिटॉल फॉस्फेट सेरामाइड (आईपीसी) मा रूपांतरण जीपीआई एंकर संश्लेषण (16) पर निर्भर करत है। कृत्रिम झिल्ली के साथ जैवभौतिक अध्ययन से पता चला है कि बहुत लंबा एसिल श्रृंखला सेरामाइड अद्वितीय भौतिक गुणन के साथ क्रमबद्ध डोमेन बनावै के लिए एकजुट होइ सकत हैं (17, 18)। ई डेटा ई परिकल्पना का जन्म देत है कि सी 26 सेरामाइड अऊर सी 26 सेरामाइड के साथ जीपीआई-एपी अपेक्षाकृत गन्दा ईआर झिल्ली लिपिड वातावरण मा व्यवस्थित क्षेत्रन या क्षेत्रन मा एकजुट होवे के लिए अपने भौतिक गुणन का उपयोग करत हैं। ई मुख्य रूप से छोट अऊर असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड्स (सी16:1 अऊर सी18:1) (19, 20) से बना अहै। ई क्षेत्र विशिष्ट ईआर निकास साइटन (ईआरईएस) पर चुनिंदा रूप से केंद्रित होइहैं, जहां सेरामाइड अऊर सेरामाइड-आधारित जीपीआई-एपी का एकै समर्पित सीओपीआईआई पुटिका (5) मा गोल्गी तक सह-परिवहन कीन जा सकत है।
यहि अध्ययन मा, हमने सुपर-रिज़ॉल्यूशन कन्फोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एससीएलआईएम) का उपयोग कइके यहि लिपिड-आधारित तंत्र का सीधे परीक्षण किहिन है, जवन एक अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जवन एक साथ फ्लोरोसेंट लेबल वाले प्रोटीन का देख सकत है। तीन-रंग अऊर तीन-आयामी (3डी) छवियन मा जीवित कोशिका मा अत्यधिक उच्च रिज़ॉल्यूशन अऊर गति होत है (21, 21)।
हमने सबसे पहिले एससीएलआईएम तकनीक का आगे परिभाषित करै के लिए लागू किहिन कि एस. सेरेविसिया मा ईआर छोड़ै के बाद सी 26 सेरामाइड समूह के साथ सामान्य जीपीआई-एपी का ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन से कैसे स्क्रीन कीन गा रहा। ईआर के वर्गीकरण के जांच करै के खातिर, हम एक आनुवंशिक प्रणाली का उपयोग किहिन जवन सीधे विवो (7, 23) मा ईआरईएस मा प्रवेश करै वाले नए संश्लेषित कार्गो का कल्पना कर सकत है। कार्गो के रूप मा, हमने ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ लेबल कीन गा सी 26 सेरामाइड-आधारित जीपीआई-एपी गैस 1 अऊर निकट-अवरक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आईआरएफपी) के साथ लेबल कीन गा ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन मिड 2 चुना, जवन दुनौ प्लाज्मा झिल्ली (24-26) का लक्ष्य बनावत हैं। sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती मा, ई दुइनौ कार्गो एक गैलेक्टोज-प्रेरक प्रमोटर अऊर एक संवैधानिक ईआरईएस मार्कर के तहत व्यक्त कीन जात हैं। अत्यधिक तापमान (37°C) पर, काहे से कि sec31-1 उत्परिवर्तन COPII कोट घटक Sec31 के कार्य का प्रभावित करत है ताकि COPII अंकुरण अऊर ईआर निर्यात का रोका जा सके, नया संश्लेषित कार्गो ईआर (23) मा जमा हो जात है। कम तापमान (24°C) तक ठंडा होए के बाद, sec31-1 उत्परिवर्ती कोशिका स्रावी क्षेत्र से बरामद होइ गइन, अऊर संचित नया सिंथेटिक कार्गो ईआर से निर्यात कीन जाय लाग। सीएलआईएम दृश्य से पता चला कि अधिकांश नए संश्लेषित गैस 1-जीएफपी अऊर मिड 2-आईआरएफपी 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद भी सेक31-1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के ईआर में जमा होत हैं अऊर फिर 5 मिनट के लिए 24 डिग्री सेल्सियस पर जारी होत हैं (चित्र 1)। चूंकि Mid2-iRFP पूरे ईआर झिल्ली पर वितरित होत है, अऊर गैस1-जीएफपी असतत ईआर झिल्ली क्षेत्र मा केंद्रित अऊर इकट्ठा होत है, यहिसे ओनकर वितरण पूरी तरह से अलग है (चित्र 1, ए से सी अऊर मूवी एस 1)। यहिके अलावा, जैसा कि चित्र 1डी मा देखा गा है, गैस1-जीएफपी क्लस्टर मा मिड2-आईआरएफपी नाहीं है। ई परिणाम बतावत हैं कि जीपीआई-एपी अऊर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन का अलग-अलग ईआर झिल्ली क्षेत्रन मा जल्दी अलग कीन गा रहा। गैस1-जीएफपी क्लस्टर एमचेरी के सीओपीआईआई कोट प्रोटीन सेक13 (चित्र 1, ई अऊर एफ, अऊर मूवी एस1) (23) से लेबल कीन गा एक विशिष्ट ईआरईएस से सटा है।
sec31-1 कोशिका गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव का व्यक्त करत हैं, एक लंबी एसिल श्रृंखला (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, हरा) अऊर ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीला) अऊर ई रचनात्मक ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (E) का 303°C के लिए मैगक्यूट कीन गा रहा मिनट, 24°C पर ले जाया गा, अऊर 5 मिनट बाद SCLIM द्वारा इमेज कीन गा। (ए से सी) एक विमान (ए) के प्रतिनिधि विलय या एकल 2डी छवि, 10 जेड-सेक्शन (बी) के 2डी प्रक्षेपण छवि या कार्गो अऊर ईआरईएस मार्करन (सी) के 3डी सेल गोलार्ध छवि देखावत है। स्केल बार 1μm (ए अऊर बी)। पैमाना इकाई 0.551 माइक्रोन (सी) है। गैस1-जीएफपी का पता असतत ईआर क्षेत्रन या क्लस्टर मा लगावा गा रहा, जबकि मिड2-आईआरएफपी का पता लगावा गा रहा अऊर पूरे ईआर झिल्ली (सी) मा वितरित कीन गा रहा। (D) ग्राफ सफेद तीर रेखा (बाएं) के साथ Gas1-GFP क्लस्टर मा Gas1-GFP अऊर Mid2-iRFP के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता देखावत है। एयू, मनमानी इकाई। (ई अऊर एफ) 3डी छवि का प्रतिनिधित्व करत हैं जवन माल अऊर ईआरईएस चिह्न का जोड़त है। विशिष्ट ईआरईएस के पास गैस1-जीएफपी क्लस्टर पावा गा रहा। पैमाना इकाई 0.551 माइक्रोन है। (एफ) सफेद ठोस तीर ईआरईएस से जुड़े गैस1-जीएफपी क्लस्टर का चिह्नित करत है। बीच अऊर दाहिने पैनल विलयित बढ़ी हुई 3डी छवि अऊर चयनित गैस1-जीएफपी क्लस्टर का एक घुमावदार दृश्य देखावत हैं।
गैस1-जीएफपी क्लस्टर अऊर एक विशिष्ट ईआरईएस के बीच निकट स्थानिक संबंध बतावत है कि गैस1-जीएफपी चयनात्मक ईआरईएस मा प्रवेश कर सकत है, जवन ईआर छोड़ै के लिए मिड2-आईआरएफपी द्वारा उपयोग कीन जाय वाली चयनात्मकता से अलग है। यहि संभावना का संबोधित करै के ताईं, हम केवल एक या दुई वस्तुअन (चित्र 2, ए से सी) के लिए ईआरईएस अनुपात का मापा। हमने पावा कि अधिकांश ईआरईएस (70%) मा केवल एक प्रकार का माल होत है। चित्र 2C के नीचे के छवि केवल गैस1-जीएफपी (चित्र 1) या केवल मिड2-आईआरएफपी (चित्र 2) के साथ ईआरईएस के दुई विशिष्ट उदाहरण देखावत है। यहिके विपरीत, लगभग 20% ईआरईएस मा दुई कार्गो होत हैं जवन एकै क्षेत्र मा ओवरलैप करत हैं। ई पावा गा कि कुछ ईआरईएस (10%) मा दुई प्रकार के कार्गो रहा, लेकिन उ स्पष्ट रूप से अलग-अलग क्षेत्रन मा अलग-थलग रहे। यहिसे, ई सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चलत है कि ईआर के निर्यात होए के बाद, जीपीआई-एपी गैस1-जीएफपी अऊर ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो मिड2-आईआरएफपी का अलग-अलग ईआरईएस (चित्र 2डी) मा विभाजित कीन जात है। ई छँटाई दक्षता पिछले जैव रासायनिक विश्लेषण (6) अऊर रूपात्मक निर्धारण (7) के साथ बहुत सुसंगत है। हम ईआरईएस (चित्र 2 ई अऊर मूवी एस 2) मा प्रवेश करै वाले क्वारंटाइन कार्गो के व्यवहार का भी देख सकत हैं। चित्र 2ई से पता चलत है कि गैस1-जीएफपी (पैनल 3) या मिड2-आईआरएफपी (पैनल 4) का केवल एक छोट हिस्सा एक तरफ से ईआरईएस मा प्रवेश करत है अऊर एक असतत क्षेत्र मा सीमित है। चित्र 2ई के पैनल 5 से पता चलत है कि गैस1-जीएफपी अऊर मिड2-आईआरएफपी कभौ-कभौ एकै ईआरईएस मा पावा जात हैं, लेकिन उ अलग-अलग तरफ से प्रवेश करत हैं अऊर अलग-अलग क्षेत्रन मा केंद्रित होत हैं जवन अलग-अलग सीओपीआईआई पुटिकाओं का प्रतिनिधित्व कर सकत हैं। हम इ भी पुष्टि किहिन कि सी 26 सेरामाइड-आधारित जीपीआई-एपी गैस 1 का चयनात्मक ईआरईएस के रूप मा देखल गै पृथक्करण अऊर वर्गीकरण विशिष्ट है काहे से कि एक अउर ट्रांसमेम्ब्रेन स्राव कार्गो, जीएफपी-टैग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन एक्सल 2 (27 ), मिड 2-आईआरएफपी के समान व्यवहार देखावत है। (चित्र एस 1 अऊर मूवी एस 3)। नए संश्लेषित Axl2-GFP का Mid2-iRFP (चित्र S1, A अऊर B) जइसन ER झिल्ली के माध्यम से वितरित कीन जात है, अऊर अधिकांश ERES (चित्र S1, B से D) मा Mid2-iRFP के साथ सह-स्थानीयकृत कीन जात है। चित्र 1 के पैनल 1 अऊर 2. एस 1 सी ईआरईएस के दुई विशिष्ट उदाहरण देखावत है जहां दुई ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो ओवरलैप होत हैं। इन मामलन मा, दुनौ सामान एक साथ ईआरईएस मा प्रवेश करत हैं (चित्र एस 1 ई, पैनल 3 अऊर मूवी एस 3)।
गैलेक्टोज प्रेरक स्राव, गैस1-जीएफपी (जीपीआई-एपी, हरा) अऊर मिड2-आईआरएफपी (टीएमपी, नीला) अऊर संवैधानिक ईआरईएस लेबलिंग सेक13-एमचेरी (ईआरईएस, मैजेंटा) का व्यक्त करै वाली sec31-1 कोशिका 37 °C पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद 24°C पर ऊष्मायन करै के बाद छवि, स्राव अऊर अवरुद्ध मिनट के बाद एससीएलआईएम के साथ। (ए से सी) कार्गो अऊर ईआरईएस द्वारा चिह्नित 10 जेड-सेक्शन के प्रतिनिधि 2डी प्रक्षेपण छवियाँ (ए; स्केल बार, 1 माइक्रोन) या 3डी सेल गोलार्ध छवियाँ (बी अऊर सी; स्केल यूनिट, 0.456 माइक्रोन)। (बी) मा निचला पैनल अऊर (सी) मा पैनल ईआरईएस (मजेंटा) [गैस1-जीएफपी (ग्रे) अऊर मिड2-आईआरएफपी (हल्का नीला)] मा मौजूद सामान का ही प्रदर्शित करै के लिए संसाधित छवियन का प्रदर्शित करत है। (सी) खुला तीर: ईआरईएस केवल एक टुकड़ा कार्गो (1 से 4) ले जात है। ग्रे तीर: ईआरईएस मा अलग-थलग कार्गो (5) होत है। सफेद ठोस तीर: सह-स्थित माल युक्त ईआरईएस। नीचे: चयनित एकल ईआरईएस मा केवल गैस1-जीएफपी (1) या मिड2-आईआरएफपी (2) होत है। स्केल बार, 100 एनएम। (D) (C) मा वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रा निर्धारण। ईआरईएस का औसत प्रतिशत जेहिमा केवल एक कार्गो (गैस1-जीएफपी या मिड2-आईआरएफपी), अलग-थलग कार्गो अऊर ओवरलैपिंग कार्गो होत है। तीन स्वतंत्र प्रयोगन मा, 54 कोशिका मा n=432। त्रुटि बार = एसडी। दु-पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002। (ई) (सी) से चिन्हित क्वारंटाइन कार्गो के चयनित ईआरईएस के 3डी छवि। गैस1-जीएफपी (हरा) (3) या मिड2-आईआरएफपी (नीला) (4) एक तरफ से ईआरईएस (मजेंटा) मा प्रवेश करत है अऊर ईआरईएस के भीतर एक छोट क्षेत्र तक सीमित है। कभौ-कभौ, दुइनौ प्रकार के माल एकै तरफ से एकै ईआरईएस (5) मा प्रवेश करत हैं अऊर ईआरईएस के भीतर एक अलग-थलग क्षेत्र तक सीमित रहत हैं। स्केल बार, 100 एनएम।
अगला, हम एक परिकल्पना का परीक्षण किहिन कि ईआर झिल्ली मा मौजूद लंबा एसिल चेन सेरामाइड (सी 26) चयनात्मक ईआरईएस मा गैस 1 के विशिष्ट क्लस्टरिंग अऊर छँटाई का चलावत है। यहि अंत तक, हम एक संशोधित खमीर तनाव GhLag1 का उपयोग किहिन, जेहिमा दुई अंतर्जात सेरामाइड सिंथेसेस Lag1 अऊर Lac1 का GhLag1 (कपास के Lag1 होमोलॉग) द्वारा प्रतिस्थापित कीन गा रहा, जेकरे परिणामस्वरूप जंगली प्रकार (चित्र 3A) (28) से छोट कोशिका झिल्ली सेरामाइड तनाव के साथ एक खमीर तनाव मिला। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण से पता चला कि जंगली-प्रकार के उपभेदों में, कुल सेरामाइड का 95% बहुत लंबा (सी 26) श्रृंखला सेरामाइड है, जबकि जीएचएलएजी 1 में, सेरामाइड का 85% बहुत लंबा (सी 18 अऊर सी 16) है। ), सेरामाइड का केवल 2% बहुत लंबा (C26) श्रृंखला सेरामाइड है। यद्यपि C18 अऊर C16 सेरामाइड अब तक GhLag1 झिल्ली मा पावा गा मुख्य सेरामाइड हैं, एमएस विश्लेषण से ई भी पुष्टि भै कि GhLag1 तनाव मा व्यक्त Gas1-GFP के GPI लंगर मा C26 सेरामाइड होत है, जवन जंगली-प्रकार के लिपिड के तुलनीय है। गुणवत्ता एकै अहै (चित्र 3ए) (26)। यहिसे, यहिके मतलब है कि सेरामाइड रीमॉडलिंग एंजाइम Cwh43 C26 सेरामाइड के लिए अत्यधिक चयनात्मक है, जैसा कि चित्र 26 मा देखा गा है, ई GhLag1 तनाव मा C26 सेरामाइड के एक छोट मात्रा से GPI लंगर का प्राथमिकता से शामिल करत है। एस2 (29) फिर भी, GhLag1 के कोशिका झिल्ली मा मूल रूप से केवल C18-C16 सेरामाइड होत है, जबकि Gas1-GFP मा अबहियों C26 सेरामाइड होत है। ई तथ्य ई तनाव का ईआर मा झिल्ली सेरामाइड के एसिल श्रृंखला लंबाई के समस्या का विशेष रूप से हल करै के लिए एक आदर्श उपकरण बनावत है। वर्ग अऊर छँटाई के काल्पनिक भूमिका। फिर, हम सबसे पहिले पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से sec31-1 के तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलील के साथ GhLag1 मा क्लस्टर मा जमा होए के लिए C26 Gas1-GFP के क्षमता का अध्ययन किहिन, जहां ईआर झिल्ली सेरामाइड (चित्र 3) मा केवल लंबा (C18-C16) श्रृंखला मौजूद है। हमने देखा कि sec31-1 मा, अधिकांश Gas1-GFP क्लस्टर मा केंद्रित रहा, जबकि लंबा (C18-C16) लंबा सेरामाइड ईआर झिल्ली के साथ sec31-1 GhLag1 मा Gas1-GFP मुख्य रूप से क्लस्टर नाहीं रहा अऊर पूरे ER झिल्ली मा वितरित कीन गा रहा। सटीक होवे के लिए, काहे से कि सी 26 सेरामाइड-आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ईआरईएस (चित्र 1) से निकटता से संबंधित है, हम अगला जांच किहिन कि का ई प्रक्रिया मा ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र के कार्य भी शामिल होइ सकत है। जीपीआई-एपी ईआर निर्यात के लिए एक विशेष सीओपीआईआई प्रणाली का उपयोग करत है, जेका जीपीआई एंकर (30, 31) के ग्लाइकन भाग के टेड 1 के संरचनात्मक पुनर्निर्माण द्वारा सक्रिय रूप से विनियमित कीन जात है। पुनः संयोजक जीपीआई-ग्लाइकन का तब ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर पी 24 कॉम्प्लेक्स द्वारा पहचाना जात है, जवन बदले मा चुनिंदा रूप से एलएसटी 1 का भर्ती करत है, जवन प्रमुख सीओपीआईआई कार्गो बाइंडिंग सबयूनिट सेक 24 का एक विशिष्ट आइसोफॉर्म है, जे जीपीआई-एपी-समृद्ध सीओपीआईआई पुटिका बनावत है (31-33)। यहिसे, हम एक डबल उत्परिवर्ती बनाइन जवन इन एकल प्रोटीन (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लाइकन रीमॉडलिंग एंजाइम Ted1 अऊर विशिष्ट COPII सबयूनिट Lst1) के विलोपन का sec31-1 उत्परिवर्ती तनाव के साथ जोड़िस, अऊर ओनके अध्ययन किहिन। हम देखेन कि sec31-1emp24Δ अऊर sec31-1ted1Δ मा, गैस1-जीएफपी मुख्य रूप से अनक्लस्टर अऊर पूरे ईआर झिल्ली मा वितरित अहै, जइसे कि पहिले सेक31-1 जीएचएलएजी1 मा देखल गै रहा, जबकि सेक31-1lst1Δ मा, गैस1-जीएफपी सेक31-111 के तरह। ई परिणाम बतावत हैं कि ईआर झिल्ली मा सी 26 सेरामाइड के उपस्थिति के अलावा, गैस 1-जीएफपी के क्लस्टरिंग का भी पी 24 कॉम्प्लेक्स से बंधे के जरूरत है, अऊर विशिष्ट एलएसटी 1 भर्ती के आवश्यकता नाहीं है। फिर, हमने ई संभावना का पता लगावा कि ईआर झिल्ली मा सेरामाइड के श्रृंखला लंबाई गैस 1-जीएफपी के पी 24 से बंधन का नियंत्रित कर सकत है। हालांकि, हमने पावा कि झिल्ली मा C18-C16 सेरामाइड के उपस्थिति p24 कॉम्प्लेक्स (चित्र S3 अऊर S4, A अऊर B) द्वारा पुनर्निर्मित GPI-ग्लाइकेन्स का प्रभावित नाहीं करत है या GPI-AP से बंधन अऊर GPI-AP का निर्यात करत है। छमता। COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C) का भर्ती करा। यहिसे, सी 26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग के लिए अलग-अलग ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र के साथ प्रोटीन बातचीत के आवश्यकता नाहीं होत है, लेकिन लिपिड लंबाई से संचालित एक वैकल्पिक छँटाई तंत्र का समर्थन करत है। फिर, हम विश्लेषण किहिन कि का ईआर झिल्ली मा सेरामाइड एसिल श्रृंखला लंबाई चयनात्मक ईआरईएस के रूप मा गैस 1-जीएफपी के प्रभावी वर्गीकरण के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि शॉर्ट-चेन सेरामाइड के साथ GhLag1 तनाव मा Gas1 ईआर छोड़ देत है अऊर प्लाज्मा झिल्ली मा प्रवेश करत है (चित्र S5), हम मानित है कि अगर छँटाई सेरामाइड एसिल श्रृंखला के लंबाई से संचालित होत है, तौ GhLag1 तनाव मा Gas1 का पुनर्निर्देशित अऊर पार कीन जा सकत है। एकै झिल्ली के साथ ईआरईएस सामान।
(A) GhLag1 के कोशिका झिल्ली मा मुख्य रूप से छोट C18-C16 सेरामाइड्स होत हैं, जबकि Gas1-GFP के GPI लंगर मा अभी भी जंगली-प्रकार के कोशिका के समान C26 IPC होत है। ऊपर: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) अऊर जीएचएलएजी 1 पी उपभेदों के कोशिका झिल्ली मा सेरामाइड का एसिल श्रृंखला लंबाई विश्लेषण। डेटा कुल सेरामाइड के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करत है। तीन स्वतंत्र प्रयोगन का औसत। त्रुटि बार = एसडी। दु-पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी ＜0.0001. निचला पैनल: जंगली-प्रकार अऊर जीएचएलएजी1पी उपभेदन मा व्यक्त गैस1-जीएफपी (जीपीआई-आईपीसी) जीपीआई लंगर मा मौजूद आईपीसी के एसिल श्रृंखला लंबाई का एमएस विश्लेषण। डेटा कुल आईपीसी सिग्नल के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करत है। पांच स्वतंत्र प्रयोगन का औसत। त्रुटि बार = एसडी। दु-पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। ns, महत्वपूर्ण नाहीं है। पी = 0.9134। (बी) गैलेक्टोज-प्रेरित गैस1-जीएफपी व्यक्त करै वाली sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ अऊर sec31-1lst1Δ कोशिका के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ का 37°C पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन करा गा रहा अऊर नियमित रूप से फ्लोरोसेंस का प्रदर्शन कीन गा रहा 24°C के बाद माइक्रोस्कोपी। सफेद तीर: ईआर गैस1-जीएफपी क्लस्टर। खुला तीर: अनक्लस्टर गैस1-जीएफपी पूरे ईआर झिल्ली पर वितरित कीन जात है, जवन ईआर विशेषता परमाणु रिंग धुंधलापन देखावत है। स्केल बार, 5 माइक्रोन। (सी) (बी) मा वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रा निर्धारण। पंक्टेट गैस1-जीएफपी संरचना वाली कोशिकाओं का औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोगन मा, n≥300 कोशिका। त्रुटि बार = एसडी। दु-पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। **** पी ＜0.0001.
ई समस्या का सीधे हल करै के लिए, हमने sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्ती एलील (चित्र 4 अऊर मूवी S4) के साथ GhLag1 मा Gas1-GFP अऊर Mid2-iRFP का SCLIM विज़ुअलाइज़ेशन किहिन। ईआर का 37°C पर रखै अऊर बाद मा 24°C पर जारी करै के बाद, अधिकांश नए संश्लेषित Gas1-GFP क्लस्टर अऊर ईआर झिल्ली मा वितरित नाहीं कीन गा रहा, जैसा कि पारंपरिक माइक्रोस्कोप (चित्र 4, ए अऊर बी) द्वारा देखल गै रहा। यहिके अलावा, ईआरईएस (67%) का एक बड़ा प्रतिशत मा दुई प्रकार के माल शामिल हैं जवन ओमा सह-स्थित हैं (चित्र 4डी)। चित्र 4सी के पैनल 1 अऊर 2 गैस1-जीएफपी अऊर मिड2-जीएफपी के ओवरलैपिंग के साथ ईआरईएस के दुई विशिष्ट उदाहरण देखावत हैं। यहिके अलावा, दुइनौ सामान एकै ईआरईएस (चित्र 4 ई, पैनल 3 अऊर मूवी एस 4) मा भर्ती कीन गा रहें। यहिसे, हमार परिणाम बतावत हैं कि ईआर झिल्ली मा सेरामाइड एसिल श्रृंखला के लंबाई ईआर प्रोटीन एकत्रीकरण अऊर वर्गीकरण का एक महत्वपूर्ण निर्धारक है।
गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, गैस1-जीएफपी (जीपीआई-एपी, हरा) अऊर मिड2-आईआरएफपी (टीएमपी, नीला) अऊर संवैधानिक ईआरईएस-लेबल सेक13-एमचेरी (ईआरईएस, मैजेंटा) का व्यक्त करै वाली Sec31-1 GhLag1 कोशिका 37°C पर ऊष्मायन करत हैं। मिनट तक जारी रखौ, स्राव छोड़ै के लिए 24°C तक गिरावौ, अऊर 20 मिनट के बाद SCLIM के साथ छवि बनावा। (ए से सी) कार्गो अऊर ईआरईएस द्वारा चिह्नित 10 जेड-सेक्शन के प्रतिनिधि 2डी प्रक्षेपण छवियाँ (ए; स्केल बार, 1 माइक्रोन) या 3डी सेल गोलार्ध छवियाँ (बी अऊर सी; स्केल यूनिट, 0.45 माइक्रोन)। (बी) मा निचला पैनल अऊर (सी) मा पैनल ईआरईएस (मजेंटा) [गैस1-जीएफपी (ग्रे) अऊर मिड2-आईआरएफपी (हल्का नीला)] मा मौजूद सामान का ही प्रदर्शित करै के लिए संसाधित छवियन का प्रदर्शित करत है। (सी) सफेद भरा तीर: ईआरईएस, माल ओवरलैप। खुला तीर: ईआरईएस मा केवल एक आइटम है। निचला पैनल: चयनित ईआरईएस मा (सी) मा चिन्हित ओवरलैपिंग माल (1 अऊर 2) हैं। स्केल बार, 100 एनएम। (D) (C) मा वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ का मात्रा निर्धारण। sec31-1 अऊर sec31-1 GhLag1 इकाइयन मा, केवल एक कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP) शामिल है, अऊर अलग-थलग कार्गो अऊर ओवरलैपिंग कार्गो के लिए ERES का औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोगन मा, 54 कोशिका (sec31-1) मा n = 432 अऊर 47 कोशिका (sec31-1 GhLag1) मा n = 430। त्रुटि बार = एसडी। दु-पूंछ वाला अयुग्मित टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 (सेकंड31-1) अऊर ** पी = 0.0031 (सेकंड31-1 जीएचएलएजी1)। (ई) (सी) मा चिन्हित ओवरलैपिंग कार्गो (3) के साथ चयनित ईआरईएस के 3डी छवि। गैस1-जीएफपी (हरा) अऊर मिड2-आईआरएफपी (नीला) एकै तरफ से ईआरईएस (मजेंटा) के पास जात हैं अऊर एकै ईआरईएस प्रतिबंधित क्षेत्र मा रहत हैं। स्केल बार, 100 एनएम।
ई अध्ययन सीधा इन विवो साक्ष्य प्रदान करत है कि लिपिड-आधारित प्रोटीन कार्गो का स्रावी मार्ग मा चयनात्मक निर्यात स्थलन मा वर्गीकृत कीन जात है, अऊर वर्गीकरण चयनात्मकता के लिए एसिल श्रृंखला लंबाई के महत्व का पता लगावत है। एससीएलआईएम नामक एक शक्तिशाली अऊर अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करत हुए, हमने खमीर मा नए संश्लेषित गैस 1-जीएफपी (एक बहुत लंबा एसिल चेन (सी 26) सेरामाइड लिपिड भाग के साथ एक प्रमुख प्लाज्मा झिल्ली जीपीआई-एपी) का प्रदर्शन किहिन) असतत ईआर मा समूहित क्षेत्र विशिष्ट ईआरईएस से जुड़े होत हैं, जबकि ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन ERRES के माध्यम से वितरित होत हैं (चित्र 1)। यहिके अलावा, ई दुइनौ प्रकार के सामान चुनिंदा रूप से अलग-अलग ईआरईएस मा प्रवेश करत हैं (चित्र 2)। झिल्ली मा सेलुलर सेरामाइड के एसिल श्रृंखला लंबाई सी 26 से सी 18-सी 16 तक कम होइ जात है, गैस 1-जीएफपी क्लस्टर असतत ईआर क्षेत्र मा बाधित होइ जात है, अऊर गैस 1-जीएफपी का उसी ईआरईएस (चित्र 3 अऊर चित्र 3) के माध्यम से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ ईआर छोड़ै के लिए पुन: रूट कीन जात है। 4).
यद्यपि जीपीआई-एपी ईआर से बाहर निकलै के लिए एक विशेष प्रोटीन तंत्र का उपयोग करत है, हमने पावा कि सी 26 सेरामाइड-निर्भर पृथक्करण विभेदक प्रोटीन इंटरैक्शन पर निर्भर नाहीं करत है जवन ईआरईएस विशेषज्ञता (चित्र एस 4 अऊर एस 5) का जन्म दे सकत है। यहिके बजाय, हमार निष्कर्ष लिपिड-आधारित प्रोटीन क्लस्टरिंग अऊर बाद मा अन्य माल के बहिष्कार से संचालित एक वैकल्पिक वर्गीकरण तंत्र का समर्थन करत हैं। हमार अवलोकन बतावत हैं कि एक विशिष्ट ईआरईएस से जुड़े गैस1-जीएफपी क्षेत्र या क्लस्टर मा ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन मिड2-आईआरएफपी के कमी है, जवन इंगित करत है कि सी26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर प्रासंगिक ईआरईएस मा ओनके प्रवेश का सुविधाजनक बनाई, अऊर साथै साथ, ट्रांसमेम्ब्रेन का बाहर कर देई स्राव ई विशेष (चित्र 1 अऊर ईआरईएस) मा प्रवेश करत हैं। यहिके विपरीत, ईआर झिल्ली मा सी18-सी16 सेरामाइड्स के उपस्थिति से जीपीआई-एपी क्षेत्र या क्लस्टर बनावै का कारण नाहीं बनत है, यहिसे उ एकै ईआरईएस (चित्र 3 अऊर 4) मा ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन का बाहर या बदलत नाहीं हैं। . यहिसे, हम प्रस्तावित करत हैं कि सी 26 सेरामाइड विशिष्ट ईआरईएस से जुड़े प्रोटीन के क्लस्टरिंग के सुविधा प्रदान कइके पृथक्करण अऊर वर्गीकरण का चलावत है।
एक विशिष्ट ईआर क्षेत्र मा ई सी 26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग का कैसे प्राप्त कीन जाय? झिल्ली सेरामाइड के पार्श्व रूप से अलग होवे के प्रवृत्ति जीपीआई-एपी अऊर सी 26 सेरामाइड का ईआर झिल्ली के अधिक अनियमित लिपिड वातावरण मा छोट अऊर असंतृप्त ग्लिसरोलिपिड युक्त छोट अऊर तुरंत क्रमबद्ध लिपिड बनावै का कारण बन सकत है। गुणवत्ता समूह (17, 18)। p24 कॉम्प्लेक्स (34) से बंधे के बाद ई छोट अस्थायी समूहन का आगे बड़े, अधिक स्थिर समूहन मा फ्यूज कीन जा सकत है। यहिके अनुरूप, हमने देखावा कि C26 Gas1-GFP का p24 कॉम्प्लेक्स के साथ बातचीत करै के जरूरत है ताकि बड़ा दृश्यमान क्लस्टर बनावा जा सके (चित्र 3)। पी 24 कॉम्प्लेक्स खमीर (35) मा चार अलग-अलग पी 24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन से बना एक विषमयुग्मजी ओलिगोमर है, जवन बहुसंयोजक बंधन प्रदान करत है, जवन छोट जीपीआई-एपी क्लस्टर के क्रॉस-लिंकिंग का जन्म दे सकत है, जेहिसे बड़ा स्थिर क्लस्टर (34) उत्पन्न होत है। जीपीआई-एपी के प्रोटीन एक्टोडोमेन के बीच बातचीत भी ओनके एकत्रीकरण मा योगदान दे सकत है, जइसे कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका (36) मा ओनके गोल्जी परिवहन के दौरान देखा गा है। हालांकि, जब सी 18-सी 16 सेरामाइड ईआर झिल्ली मा मौजूद होत है, जब पी 24 कॉम्प्लेक्स गैस 1-जीएफपी से बंध जात है, तौ बड़े अलग-अलग क्लस्टर नाहीं बनत हैं। अंतर्निहित तंत्र लंबी एसिल श्रृंखला सेरामाइड के विशिष्ट भौतिक अऊर रासायनिक गुणन पर निर्भर कर सकत है। कृत्रिम झिल्ली के जैवभौतिक अध्ययन से पता चलत है कि यद्यपि लंबा (सी 24) अऊर छोट (सी 18-सी 16) दुनौ एसिल श्रृंखला सेरामाइड चरण पृथक्करण का कारण बन सकत हैं, केवल लंबा एसिल श्रृंखला सेरामाइड (सी 24) ही फिल्म का फिर से आकार देय के लिए उच्च वक्रता अऊर फिल्म झुकाव का बढ़ावा दे सकत हैं। आपसी संदर्भ (17, 37, 38) के माध्यम से। ई देखा गा है कि TMED2 का ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स, Emp24 का मानव समरूप, कोशिका द्रव्य लोब्यूल्स (39) मा C18 सेरामाइड-आधारित स्फिंगोमाइलिन के साथ चुनिंदा रूप से बातचीत करत है। आणविक गतिकी (एमडी) सिमुलेशन का उपयोग करत हुए, हमने पावा कि सी 18 अऊर सी 26 सेरामाइड दुनौ Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स के कोशिका द्रव्य लोब्यूल्स के आसपास जमा होत हैं, अऊर ओनके पास समान वरीयताएं हैं (चित्र एस 6)। ई ध्यान देय लायक है कि ई इंगित करत है कि Emp24 के ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स झिल्ली मा लिपिड के असममित वितरण का जन्म दे सकत है। ई स्तनधारी कोशिका के आधार पर एक हालिया परिणाम है। समान एमडी सिमुलेशन ईथर लिपिड (40) के उपस्थिति भी देखावत हैं। यहिसे, हम अनुमान लगावत हैं कि ईआर26 के दुइनौ लोब्यूल मा सी26 सेरामाइड स्थानीय रूप से समृद्ध है। जब लुमिनल लोब्यूल्स मा जीपीआई-एपी सीधे बहुसंयोजक पी 24 से बंधत है अऊर कोशिका द्रव्य लोब्यूल्स मा पी 24 के आसपास सी 26 सेरामाइड का संचय होत है, तौ ई साथ मा प्रोटीन एकत्रीकरण अऊर झिल्ली वक्रता का बढ़ावा दे सकत है, उंगली (41) के माध्यम से उत्पन्न होत हैं, जेहिसे जीपीआई-एपी ईआरईएस के उच्च क्षेत्रन के पक्ष मा असतत क्षेत्रन मा अलग हो जात है ईआर झिल्ली (42) पिछली रिपोर्ट प्रस्तावित तंत्र (43, 44) का समर्थन करत रहीं। प्लाज्मा झिल्ली पर सेरामाइड-आधारित ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड्स (जीएसएल) के लिए ओलिगोलेक्टिन, रोगजनक या एंटीबॉडी का बहुसंयोजी बंधन बड़े जीएसएल एकत्रीकरण का ट्रिगर करत है, चरण पृथक्करण का बढ़ावत है अऊर झिल्ली विरूपण अऊर आंतरिककरण का कारण बनत है (44)। इवाबुची आदि (43) ई पावा गा कि लंबा (सी 24) लेकिन छोट (सी 16) एसिल श्रृंखला के उपस्थिति मा, जीएसएल लैक्टोसिलसेरामाइड से बंधे बहुसंयोजी लिगैंड ने बड़े समूहन अऊर झिल्ली आक्रमण के गठन का प्रेरित किहिन, अऊर पत्रिकाओं पर कोशिका द्रव्य लिन-मध्यस्थता संकेत संचरण न्यूट्रोफिल जोड़न मा एक न्यूट्रोफिल चेन द्वारा अंतरालित कीन जात है।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका मा, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के स्तर तक एंटी-गोल्गी नेटवर्क (टीजीएन) के एकाग्रता जीपीआई-एपी (10, 45) के पृथक्करण अऊर छँटाई का नियंत्रित करत है। ई एकत्रीकरण जीपीआई-एपी ओलिगोमराइजेशन (36) द्वारा संचालित होत है, लेकिन ई खमीर मा हमरे द्वारा पाए जाने वाले सेरामाइड श्रृंखला लंबाई पर भी निर्भर हो सकत है। यद्यपि स्तनधारी जीपीआई-एपी मा ईथर लिपिड-आधारित लंगर होत है, अऊर एकर रासायनिक संरचना बहुत लंबा एसिल चेन सेरामाइड से बहुत अलग होत है, एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि दुनौ लिपिड मा विकासवादी रूप से समान भौतिक अऊर रासायनिक गुण अऊर कार्य होत हैं (40)। यहिसे, स्तनधारी कोशिका मा ईथर लिपिड भाग खमीर मा सी 26 सेरामाइड के समान हो सकत है, अऊर एकर भूमिका जीपीआई-एपी एकत्रीकरण अऊर छँटाई का बढ़ावा देय के लिए झिल्ली मा लंबी श्रृंखला सेरामाइड के साथ जुड़ब है। यद्यपि ई संभावना का अबहियों सीधे परीक्षण करै के जरूरत है, पिछला निष्कर्ष ई बात का समर्थन करत हैं कि गोल्जी शरीर मा लंबा एसिल चेन सेरामाइड का परिवहन कोशिका द्रव्य हस्तांतरण प्रोटीन द्वारा नाहीं कीन जात है, बल्कि खमीर जइसन जीपीआई लंगर के संश्लेषण पर निर्भर करत है। यहिसे, विकासवादी रूढ़िवादी तंत्र एकै परिवहन पुटिका मा बहुत लंबा एसिल चेन सेरामाइड अऊर जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) का चुनिंदा रूप से सह-परिवहन करै में सक्षम लागत है।
खमीर अऊर स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका प्रणाली मा, जीपीआई-एपी एकत्रीकरण अऊर अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन से अलगाव सब कोशिका सतह तक पहुँचै से पहिले होत है। पलाडिनो एट अल (48) पावा गा कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका के टीजीएन पर, जीपीआई-एपी क्लस्टरिंग न केवल जीपीआई-एपी के एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के चयनात्मक वर्गीकरण के लिए आवश्यक है, बल्कि जीपीआई-एपी के क्लस्टरिंग संगठन अऊर ओकर जैविक गतिविधि का भी नियंत्रित करत है। कोशिका सतह। खमीर मा, ई अध्ययन से पता चला कि ईआर पर सी 26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर प्लाज्मा झिल्ली पर जीपीआई-एपी के क्लस्टर संगठन अऊर कार्यात्मक गतिविधि का नियंत्रित कर सकत है (24, 49)। यहि मॉडल के अनुरूप, GhLag1 कोशिका GPI अवरोधक या दवाओं से एलर्जी होत हैं जवन कोशिका भित्ति अखंडता (28) का प्रभावित करत हैं, अऊर खमीर कोशिका के संभोग मा प्रक्षेपित टिप सेरामाइड के कार्यात्मक Gas1-GFP क्लस्टर (49) के जरूरत G hLag1 कोशिका के संभावित शारीरिक परिणामन का इंगित करत है। जीपीआई-एपी त्रुटि। हालांकि, आगे परीक्षण करब कि का कोशिका सतह के कार्यात्मक संगठन का लिपिड लंबाई के आधार पर छँटाई विधि से ईआर से प्रोग्राम कीन गा है, हमरे भविष्य के शोध का विषय होई।
यहि काम मा उपयोग कीन गा सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया उपभेद तालिका S1 मा सूचीबद्ध हैं। लाइव सेल इमेजिंग के लिए एससीएलआईएम के एमएमवाई1583 अऊर एमएमवाई1635 उपभेदन का निर्माण डब्ल्यू303 के पृष्ठभूमि मा कीन गा रहा। एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के साथ Sec13-mCherry का व्यक्त करै वाले ई उपभेदन का निर्माण एक टेम्पलेट के रूप मा pFA6a प्लास्मिड के साथ एक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)-आधारित विधि का उपयोग कइके कीन गा रहा (23)। GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण मा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल Mid2-iRFP व्यक्त करै वाला तनाव निम्नलिखित रूप से बनावा गा रहा। pKTiRFP-KAN वेक्टर (ई. ओ'शी का उपहार, एडजेन प्लास्मिड संख्या 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; शोध संसाधन पहचानकर्ता (आरआरआईडी): एडजेन_64687) से आईआरएफपी-केनएमएक्स अनुक्रम का पीसीआर प्रवर्धन अऊर अंतर्जात मिडजेनस मा डाला गा है। Mid2-iRFP जीनोम अनुक्रम का बढ़ावै अऊर GAL1 प्रमोटर मा क्लोन करै के बाद, ई एकीकरण प्लास्मिड pRS306 के Not I-Sac I साइट मा एकीकृत कीन गा रहा। परिणामी प्लास्मिड pRGS7 का URA3 लोकस मा एकीकृत करै के लिए Pst I के साथ रैखिक बनावा गा रहा।
गैस1-जीएफपी फ्यूजन जीन सेंट्रोमेर (सीईएन) प्लास्मिड मा जीएएल1 प्रमोटर के नियंत्रण मा व्यक्त कीन जात है, जेकर निर्माण निम्नानुसार कीन जात है। गैस1-जीएफपी अनुक्रम का पीआरएस416-जीएएस1-जीएफपी प्लास्मिड (24) (एल. पोपोलो का उपहार) से पीसीआर द्वारा प्रवर्धित कीन गा रहा अऊर सीईएन प्लास्मिड पीबीईवीवाई-जीएल एलईयू2 (सी का उपहार) के एक्सएमए आई-एक्सएचओ आई साइट मा क्लोन कीन गा रहा। मिलर; एडजीन प्लास्मिड संख्या 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; आरआरआईडी: एडजीन_51225)। परिणामी प्लास्मिड का नाम pRGS6 रखा गा रहा। Axl2-GFP संलयन जीन pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के GAL1 प्रमोटर के नियंत्रण मा भी व्यक्त कीन जात है, अऊर एकर निर्माण निम्नलिखित है। Axl2-GFP अनुक्रम का पीसीआर द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लास्मिड (23) से प्रवर्धित कीन गा रहा, अऊर pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के Bam HI-Pst I साइट मा क्लोन कीन गा रहा। परिणामी प्लास्मिड का नाम pRGS12 रखा गा रहा। यहि अध्ययन मा उपयोग कीन गा ओलिगोन्यूक्लियोटाइडन के अनुक्रम तालिका S2 मा सूचीबद्ध अहै।
तनाव का 0.2% एडेनिन अऊर 2% ग्लूकोज [वाईपी-डेक्सट्रोज (वाईपीडी)], 2% रैफिनोज [वाईपी-रैफिनोज] समृद्ध खमीर अर्क प्रोटीन पी (वाईपी) माध्यम (1% खमीर अर्क अऊर 2% प्रोटीन ईपीटी) के साथ पूरक बनावा गा रहा। (YPR)] या 2% गैलेक्टोज [YP-गैलेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोत के रूप मा, या पोषण के लिए आवश्यक उचित अमीनो एसिड अऊर आधारन के पूरक के रूप मा एक सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (0.15% खमीर नाइट्रोजन आधार अऊर 0.5% अमोनियम सल्फेट) मा, अऊर 2% ग्लूकोज (2% ग्लूकोज) या न्यूनतम ग्लूकोज युक्त कार्बन स्रोत के रूप मा गैलेक्टोज (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतम माध्यम)।
वास्तविक समय इमेजिंग के लिए, GAL1 प्रमोटर के तहत निर्माण का व्यक्त करै वाली तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं का YPR माध्यम मा 24°C पर रात भर से मध्य-लॉग चरण तक उगावा गा रहा। घंटा के लिए 24°C पर वाईपीजी मा प्रेरण के बाद, कोशिका का 30 मिनट के लिए 37°C पर एसजी मा ऊष्मायन करा गा रहा, अऊर फिर स्राव ब्लॉक से रिलीज करै के लिए 24°C मा स्थानांतरित कीन गा रहा। कॉन्कानावलिन ए का उपयोग एक ग्लास स्लाइड पर कोशिकाओं का ठीक करै के लिए कीन गा रहा अऊर एससीएलआईएम द्वारा इमेज कीन गा रहा। एससीएलआईएम ओलिंप IX-71 उल्टा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप अऊर यूप्लानएसएपीओ 100×1.4 संख्यात्मक एपर्चर ऑयल लेंस (ओलिंप), उच्च गति अऊर उच्च-संकेत-से-शोर अनुपात घूर्णन डिस्क कन्फोकल स्कैनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर, कस्टोफायर कस्टोफायर इमेजिंग सिस्टम अऊर इमेज का एक संयोजन है (हमामात्सु फोटोनिक्स) ×266.7 के अंतिम आवर्धन के साथ एक आवर्धक लेंस प्रणाली प्रदान कर सकत है अऊर एक चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा जवन इलेक्ट्रॉनन का गुणा करत है (हमामात्सु फोटोनिक्स) (21)। छवि अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारा कीन जात है। 3डी छवियन के लिए, हमने उद्देश्य लेंस का लंबवत रूप से कंपन करै के लिए एक कस्टम-मेड पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर का उपयोग किहिन, अऊर एक ढेर मा 100 एनएम अलग ऑप्टिकल भागन का एकत्र किहिन। जेड-स्टैक छवि का 3डी वोक्सेल डेटा मा बदला जात है, अऊर घूर्णन डिस्क कन्फोकल माइक्रोस्कोप के लिए उपयोग कीन जाय वाला सैद्धांतिक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन का उपयोग वोलोसिटी सॉफ्टवेयर (पर्किनएलमर) द्वारा विघटन प्रसंस्करण के लिए कीन जात है। सह-स्थान विश्लेषण के लिए स्वचालित रूप से थ्रेसहोल्ड करै के लिए वोलोसिटी सॉफ्टवेयर का उपयोग कइके, कार्गो सहित ईआरईएस का मापा गा रहा। लाइन स्कैन विश्लेषण मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर (आणविक उपकरण) का उपयोग कइके कीन गा रहा।
सांख्यिकीय महत्व का निर्धारित करै के लिए ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर का उपयोग करा। दुई-पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्ट अऊर साधारण एकतरफा विश्लेषण के भिन्नता (एनोवा) परीक्षण के लिए, समूहन के बीच के अंतर का पी <0.05 (*) पर महत्वपूर्ण प्रभाव माना जात है।
गैस1-जीएफपी के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए, लॉग चरण कोशिकाओं का वाईपीडी मा रात भर उगावा गा रहा अऊर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकत्रित कीन गा रहा, फॉस्फेट बफर खारा के साथ दुई बार धोवा गा रहा, अऊर कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन करा गा रहा, अऊर फिर माइक्रोस्कोप के नीचे आगे बढ़ा गा रहा जइसे कि पहिले वर्णित चेक (24)। अधिग्रहण के लिए एक उद्देश्य लेंस, एल 5 (जीएफपी) फिल्टर, हममात्सु कैमरा अऊर एप्लिकेशन सूट एक्स (एलएएस एक्स) सॉफ्टवेयर से लैस लीका डीएमआई 8 माइक्रोस्कोप (एचसीएक्स पीएल एपीओ 1003/1.40 ऑयल पीएच 3 सीएस) का उपयोग कीन गा रहा। .
नमूना 10 मिनट के लिए 65°C पर एसडीएस नमूना बफर के साथ विकृत कीन गा रहें, अऊर फिर एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (पेज) द्वारा अलग कीन गा रहें। इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण के लिए, 10 μl नमूना प्रति लेन लोड कीन गा रहा। प्राथमिक एंटीबॉडी: 1:3000 के कमजोर पड़ने पर खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-गैस1, 1:500 के कमजोर पड़ने पर खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-Emp24 अऊर 1:3000 के कमजोर पड़ने पर खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी (एच. रीज़मैन का उपहार) का उपयोग करा। माउस मोनोक्लोनल एंटी-पीजीके 1 एंटीबॉडी का उपयोग 1:5000 (जे. डे ला क्रूज से एक उपहार) के कमजोर पड़ने पर कीन गा रहा। द्वितीयक एंटीबॉडी: हॉर्सरैडिश पेरोक्सिडेज (एचआरपी) संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) 1:3000 (पियर्स) के कमजोर पड़ने पर उपयोग कीन जात है। एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी का उपयोग 1:3000 (पियर्स) के कमजोर पड़ने पर कीन गा रहा। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के केमिलुमिनेसेंस विधि से देखल गै रहा।
जैसा कि (31) मा वर्णित है, समृद्ध ईआर अंश पर एक प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन प्रयोग कीन गा रहा। संक्षेप मा, खमीर कोशिका का टीएनई बफर [50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.5), 150 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईडीटीए, 1 एमएम फेनिलमेथिलसल्फोनिल फ्लोराइड अऊर प्रोटीज अवरोधक मिश्रण) से 600 एनएम (ओडी600) पर 100 ऑप्टिकल घनत्व पर दुगुना धोवा। ई कांच के मोती से तोड़ा गा रहा, अऊर फिर सेल मलबा अऊर कांच के मोती का अपकेंद्रण द्वारा हटावा गा रहा। तब सुपरनेटेंट का 4°C पर 15 मिनट के लिए 17,000 g पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। गोली का टीएनई मा फिर से निलंबित कीन गा रहा अऊर डिजिटलिस सैपोनिन का 1% के अंतिम सांद्रता मा जोड़ा गा रहा। निलंबन का 4°C पर घूर्णन के साथ 1 घंटा के लिए ऊष्मायन करा गा रहा, अऊर फिर अघुलनशील घटकन का 60 मिनट के लिए 4°C पर 13,000 g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटावा गा रहा। गैस1-जीएफपी इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के लिए, पहिले नमूना का 1 घंटा के लिए 4°C पर खाली अगरोस मोती (क्रोमोटेक) के साथ पूर्व-ऊष्मायन करा, अऊर फिर 3 घंटा के लिए 4°C पर जीएफपी-ट्रैप_ए (क्रोमोटेक) के साथ ऊष्मायन करा। इम्यूनोप्रेसिपिटेड मोती का 0.2% डाइगोक्सिजेनिन युक्त टीएनई से पांच बार धोवा गा रहा, एसडीएस नमूना बफर से अलग कीन गा रहा, एसडीएस-पेज पर अलग कीन गा रहा, अऊर इम्यूनोब्लॉटिंग द्वारा विश्लेषण कीन गा रहा।
जैसा कि (31) मा वर्णित है, समृद्ध ईआर अंश पर क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण कीन गा रहा। संक्षेप मा, समृद्ध ईआर अंश का 0.5 एमएम डाइथियोबिस (सक्सिनिमिडिल प्रोपियोनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, यूएसए; 20 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। ग्लाइसिन (50 एमएम अंतिम एकाग्रता, 5 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस) जोड़ के क्रॉसलिंकिंग प्रतिक्रिया का बुझावा गा रहा।
जैसा कि पहिले वर्णित (50), जंगली-प्रकार अऊर GhLag1 उपभेदन मा सेरामाइड का एमएस विश्लेषण कीन गा रहा। संक्षेप मा, कोशिका 30°C पर वाईपीडी मा घातीय चरण (3 से 4 ओडी600 इकाइयन/एमएल) तक उगावा गा रहा, अऊर 25×107 कोशिका काटा गा रहा। ओनके चयापचय का ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड से बुझावा जात है। निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडीन अऊर 4.2 एन अमोनियम हाइड्रोक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] अऊर 1.2 एनएमओएल आंतरिक मानक सी 17 सेरामाइड (860517, अवंती ध्रुवीय लिपिड) गुणवत्ता का उपयोग करा। अर्क के हल्का क्षारीय जल अपघटन करै के लिए मोनोमेथिलामाइन अभिकर्मक [मेथनॉल, पानी, एन-ब्यूटानॉल अऊर मिथाइलामाइन घोल (4:3:1:5 v/v)] का उपयोग करा, अऊर फिर नमक हटावै के लिए पानी से संतृप्त एन-ब्यूटानॉल का उपयोग करा। अंत मा, अर्क का एक सकारात्मक मोड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी (2:7:1) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] मा फिर से निलंबित कीन गा अऊर मास स्पेक्ट्रोमीटर मा इंजेक्ट कीन गा। स्फिंगोलिपिड अणुओं के पहचान अऊर मात्रा निर्धारण के लिए बहु-प्रतिक्रिया निगरानी (एमआरएम) कीन गा रहा। टीएसक्यू वैंटेज तृतीयक क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) लिपिड विश्लेषण के लिए एक रोबोट नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट एचडी (एडवियन बायोसाइंसेज, इथाका, एनवाई) से लैस है। टकराव ऊर्जा हर सेरामाइड श्रेणी के लिए अनुकूलित है। एमएस डेटा सकारात्मक मोड मा प्राप्त कीन गा रहा। हर जैविक प्रतिकृति के लिए, लिपिड संकेत तीन स्वतंत्र माप का माध्य है।
जैसा कि (31) मा वर्णित है, गैस1-जीएफपी व्यक्त करै वाली कोशिका (800×107) प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के अधीन रहीं। शुद्ध गैस1-जीएफपी का एसडीएस-पेज द्वारा अलग कीन गा रहा अऊर एक पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली मा स्थानांतरित कीन गा रहा। प्रोटीन का एमाइड ब्लैक से पीवीडीएफ का धुंधला कइके देखल गै रहा। गैस1-जीएफपी बैंड का पीवीडीएफ से काटा गा रहा अऊर मेथनॉल से 5 बार अऊर एक बार तरल क्रोमैटोग्राफी-एमएस (एलसी-एमएस) ग्रेड पानी से धोवा गा रहा। झिल्ली पट्टी का 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर अऊर 500μl ताजा घुले 1 M सोडियम नाइट्राइट मिश्रण के साथ 37°C पर 3 घंटा के लिए ऊष्मायन करके, लिपिड अंश Gas1-GFP से जारी कीन जात है अऊर सेरामीनोइट अऊर सेरामिनोड के बीच इनइनोफियोसफाइओसिन रिलीज का lysed कीन जात है (51) वहिके बाद, झिल्ली पट्टी का एलसी-एमएस ग्रेड पानी से चार बार धोवा गा, कमरा के तापमान पर सुखावा गा, अऊर विश्लेषण तक -80°C पर नाइट्रोजन वातावरण मा संग्रहीत कीन गा। एक नियंत्रण के रूप मा, हर प्रयोग के लिए पीवीडीएफ झिल्ली का एक खाली नमूना उपयोग कीन गा रहा। गैस1-जीएफपी से निकाला गा लिपिड का तब एमएस द्वारा वर्णित (50) के अनुसार विश्लेषण कीन गा रहा। संक्षेप मा, जीपीआई-लिपिड युक्त पीवीडीएफ पट्टियन का 75μl नकारात्मक मोल्ड विलायक [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (1:2) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] मा फिर से निलंबित कीन गा रहा अऊर इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)-एमआरएम/एमएस स्फिंगोलिपिड प्रजाति (टीएसक्यू वैंटेज) का विश्लेषण पास कीन गा रहा। यहि मामला मा, एमएस डेटा नकारात्मक आयन मोड मा प्राप्त कीन गा रहा।
जैसा कि पहिले बतावा गा है, जीपीआई लंगर के लिपिड भाग [3H]-इनोसिटॉल-लेबल जीपीआई-एपी (16) से अलग कीन गा रहा। लिपिड का एक विलायक प्रणाली (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-0.25% केसीएल) का उपयोग कइके पतली-परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कीन गा रहा अऊर एफएलए-7000 (फुजीफिल्म) का उपयोग कइके दृश्यमान कीन गा रहा।
गैस1-जीएफपी (600×107) व्यक्त करै वाली कोशिका का टीएनई बफर के साथ टीएनई बफर से दुइ बार धोवा गा रहा, अऊर कांच के मोती से तोड़ा गा रहा, अऊर फिर कोशिका मलबा अऊर कांच के मोती का हटावै के लिए सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। तब सुपरनेटेंट का 17,000 ग्राम पर 4°C पर 1 घंटा के लिए सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। गोली का टीएनई मा धोवा गा रहा अऊर 37°C पर 1 घंटा के लिए 0.2% डिजिटलिस सैपोनिन युक्त टीएनई मा 1 यू पीआई-पीएलसी (इन्विट्रोजन) के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। एंजाइम उपचार के बाद, झिल्ली का 17,000 ग्राम पर 4°C पर 1 घंटा के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दीन गा रहा। गैस1-जीएफपी का इम्यूनोप्रेसिपिटेट करै के लिए, सुपरनेटेंट का रात भर 4°C पर जीएफपी-ट्रैप_ए (क्रोमोटेक) के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। एसडीएस-पेज द्वारा अलग कीन गा शुद्ध गैस1-जीएफपी का कूमासी शानदार नीले रंग से दाग दीन गा रहा। गैस1-जीएफपी धुंधला बैंड का जलमार्ग के आसपास के ग्रे से काट दीन गा रहा, अऊर फिर आयोडोएसीटामाइड के साथ अल्काइलेशन अऊर डाइथियोथ्रेइटोल के साथ कमी के बाद, ट्रिप्सिन के साथ इन-जेल पाचन करा गा रहा। जीपीआई-ग्लाइकेन के साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स अऊर पेप्टाइड्स का निकालौ अऊर सूखौ। सूखे पेप्टाइड का 20 μl पानी मा घुलावा गा रहा। एलसी मा एक हिस्सा (8μl) इंजेक्ट करा। विशिष्ट ढाल परिस्थितियन मा पेप्टाइड्स का अलग करै के लिए एक ऑक्टाडेसिलसिलेन (ओडीएस) कॉलम (डेवेलोसिल 300ओडीएस-एचजी-5; आंतरिक व्यास 150 मिमी × 1.0 मिमी; नोमुरा केमिकल, ऐची प्रान्त, जापान) का उपयोग कीन गा रहा। मोबाइल चरण विलायक ए (0.08% फार्मिक एसिड) अऊर विलायक बी (80% एसीटोनाइट्रिल मा 0.15% फार्मिक एसिड) है। एक एक्सेला एचपीएलसी सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, बोस्टन, मैसाचुसेट्स) का उपयोग 55 मिनट के भीतर विलायक ए के साथ स्तंभ का 5 मिनट के लिए 50 μl min-1 के प्रवाह दर से अलग करै के लिए कीन गा रहा, अऊर फिर विलायक बी के सांद्रता 40% तक बढ़ा दीन गा रहा। , संयुक्त राज्य अमेरिका)। एल्यूएट का लगातार ईएसआई आयन स्रोत मा पेश कीन गा रहा, अऊर जीपीआई-ग्लाइकेन के साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइड्स अऊर पेप्टाइड्स का एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल (हाइब्रिड लीनियर आयन ट्रैप-ऑर्बिट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर साइंटिफिक) द्वारा विश्लेषण कीन गा रहा। एमएस सेटअप मा, केशिका स्रोत का वोल्टेज 4.5 केवी पर सेट कीन गा रहा, अऊर स्थानांतरण केशिका का तापमान 300°C पर रखा गा रहा। केशिका वोल्टेज अऊर ट्यूब लेंस वोल्टेज क्रमशः 15 वी अऊर 50 वी पर सेट कीन गा रहा। एमएस डेटा सकारात्मक आयन मोड (60,000 का रिज़ॉल्यूशन; 10 भाग प्रति मिलियन का द्रव्यमान सटीकता) मा 300/m/z द्रव्यमान/चार्ज अनुपात (m/z) 3000 के द्रव्यमान सीमा मा प्राप्त कीन गा रहा। एमएस/एमएस डेटा एलटीक्यू रैप ऑर्बिट मा आयन जाल के माध्यम से प्राप्त कीन जात है। टक्कर से प्रेरित विघटन (सीआईडी)]।
एमडी सिमुलेशन ग्रोमैक्स (52) सॉफ्टवेयर अऊर मार्टिनी 2 फोर्स फील्ड (53-55) का उपयोग कइके कीन गा रहा। तब CHARMM GUI झिल्ली बिल्डर (56, 57) का उपयोग डायोलिओइलफॉस्फेटिडाइलकोलिन (DOPC) अऊर Cer C18 या DOPC अऊर Cer C26 युक्त एक बाईलेयर बनावै के लिए कीन गा रहा। स्फिंगोसिन पूंछ से अतिरिक्त मोती का हटा के Cer C26 के टोपोलॉजी अऊर निर्देशांक DXCE से प्राप्त कीन जात हैं। डबल लेयर का संतुलित करै अऊर ओका चलावै के लिए नीचे वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करा, फिर Emp24 युक्त सिस्टम बनावै के लिए सिस्टम के अंतिम निर्देशांक का उपयोग करा। खमीर Emp24 (अवशेष 173 से 193) के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन का दृश्य एमडी (वीएमडी) उपकरण आणविक संरचना (58) का उपयोग कइके एक α-हेलिक्स के रूप मा बनावा गा रहा। फिर, ओवरलैपिंग लिपिड का हटावै के बाद, प्रोटीन का मोटे तौर पर दानेदार बनावा गा अऊर CHARMM GUI का उपयोग कइके बाईलेयर मा डाला गा। अंतिम प्रणाली मा 1202 डीओपीसी अऊर 302 सीईआर सी26 या 1197 डीओपीसी अऊर 295 सीईआर सी18 अऊर एमपी24 शामिल हैं। सिस्टम का 0.150M के सांद्रता तक आयनीकृत करा। दुई द्विस्तरीय रचनाओं के लिए चार स्वतंत्र प्रतिकृति बनाई गईं।
लिपिड बाईलेयर का CHARMM GUI प्रक्रिया का उपयोग कइके संतुलित कीन जात है, जेहिमा 405,000 चरणन का कम से कम करब अऊर फिर संतुलित करब शामिल है, जहां स्थिति बाधाओं का धीरे-धीरे कम अऊर खतम कीन जात है, अऊर समय चरण 0.005 ps से 0.02 ps तक बढ़ावा जात है। संतुलन के बाद, ई 0.02 पीएस के समय चरण के साथ 6 μs पैदा करत है। Emp24 डाले के बाद, सिस्टम का कम अऊर संतुलित करै के लिए उहै CHARMM GUI प्रक्रिया का उपयोग करा, अऊर फिर उत्पादन मा 8 सेकंड तक चलावा।
सब प्रणालिन के लिए, संतुलन प्रक्रिया के दौरान, दबाव का बेरेंडसेन बैरोस्टैट (59) द्वारा नियंत्रित कीन जात है, अऊर उत्पादन प्रक्रिया के दौरान, दबाव का पररिनेलो-रहमान बैरोस्टैट (60) द्वारा नियंत्रित कीन जात है। सब मामलन मा, औसत दबाव 1 बार है अऊर एक अर्ध-समरूप दबाव युग्मन योजना का उपयोग कीन जात है। संतुलन अऊर उत्पादन प्रक्रिया मा, गति पुनर्मापन के साथ एक थर्मोस्टेट (61) का उपयोग क्रमशः प्रोटीन, लिपिड अऊर विलायक कणन के तापमान का जोड़ै के लिए कीन जात है। पूरे संचालन के दौरान, लक्ष्य तापमान 310K है। गैर-बंधन बातचीत 0.005 बफर सहिष्णुता के साथ वर्लेट योजना का उपयोग कइके एक युग्मन सूची उत्पन्न कइके गणना कीन जात है। कूलोम्ब पद के गणना प्रतिक्रिया क्षेत्र अऊर 1.1 एनएम के कट-ऑफ दूरी का उपयोग कइके कीन जात है। वंडर वाल्स शब्द 1.1 एनएम के कट-ऑफ दूरी के साथ एक कट-ऑफ योजना का उपयोग करत है, अऊर संभावित बहाव (62) के लिए वर्लेट कट-ऑफ योजना का उपयोग कीन जात है।
वीएमडी का उपयोग करत हुए, डीओपीसी फॉस्फेट बीड्स या सेरामाइड एएम 1 बीड्स अऊर प्रोटीन के बीच कटऑफ तरंग दैर्ध्य 0.7 एनएम है, अऊर प्रोटीन के साथ बातचीत करै वाले लिपिडन के संख्या के गणना कीन जात है। निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, (63) के रूप मा कमी-संवर्धन (डीई) कारक के गणना करा: डीई कारक = (प्रोटीन मा कुल लिपिड के मात्रा 0.7) प्रोटीन 0.7 मा (कुल लिपिड मा सीईआर के मात्रा)
रिपोर्ट कीन गा मान औसत के रूप मा प्राप्त कीन जात है, अऊर त्रुटि बार एसई के चार स्वतंत्र प्रतियां हैं। डीई कारक के सांख्यिकीय महत्व टी परीक्षण [(औसतडीई-कारक-1)/एसई] द्वारा गणना कीन जात है। एक-पूंछ वाले वितरण से पी मान के गणना करा।
ट्रेस के अंतिम 250 एनएस के भीतर Emp24 युक्त सिस्टम के 2D पार्श्व घनत्व मानचित्र के गणना करै के लिए GROMACS उपकरण का उपयोग कीन गा रहा। सेरामाइड के संवर्धन/क्षय मानचित्र प्राप्त करै के खातिर, सीईआर के घनत्व मानचित्र का सीईआर अऊर डीओपीसी के मानचित्र के योग से विभाजित कीन जात है, अऊर फिर शरीर मा सीईआर के एकाग्रता से विभाजित कीन जात है। एकै रंग मानचित्र पैमाना का उपयोग कीन जात है।
यहि लेख के लिए पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 देखौ
ई एक खुला पहुंच लेख है जवन क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-नॉन-कमर्शियल लाइसेंस के शर्तन के तहत वितरित कीन जात है, जवन कौनो भी माध्यम मा उपयोग, वितरण अऊर पुनरुत्पादन के अनुमति देत है, जब तक कि अंतिम उपयोग व्यावसायिक लाभ के लिए न होय ​​अऊर आधार ई होय कि मूल काम सही होय। हवाला।
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