लेख शोध विषय "रोगजनकों अऊर कीटों के प्रति फलियन के प्रतिरोध में सुधार" का हिस्सा है, सब 5 लेख देखौ
फंगल पौधा रोग परिगलन स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डी बैरी का कारण एजेंट अलग-अलग मेजबान पौधन का संक्रमित करै के लिए एक बहु-स्तरीय रणनीति का उपयोग करत है। ई अध्ययन डायमिन एल-ऑर्निथिन के उपयोग का प्रस्तावित करत है, जवन एक गैर-प्रोटीन अमीनो एसिड है जवन अन्य आवश्यक अमीनो एसिड के संश्लेषण का उत्तेजित करत है, एक वैकल्पिक प्रबंधन रणनीति के रूप मा फेसियोलस वल्गरिस एल. के आणविक, शारीरिक अऊर जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का बढ़ावै के लिए स्यूडोमोनाटियोरोम स्क्लेरोम के कारण सफेद मोल्ड के लिए है। इन विट्रो प्रयोगन से पता चला कि एल-ऑर्निथिन खुराक-निर्भर तरीका से एस. पाइरेनोइडोसा के मायसेलियल विकास का महत्वपूर्ण रूप से रोकत है। यहिके अलावा, ई ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा सफेद मोल्ड के गंभीरता का काफी कम कइ सकत है। इसके अलावा, एल-ऑर्निथिन ने उपचारित पौधन के विकास का उत्तेजित किहिन, जेसे पता चलत है कि एल-ऑर्निथिन के परीक्षण कीन गा सांद्रता उपचारित पौधन के लिए फाइटोटॉक्सिक नाहीं रहीं। यहिके अलावा, एल-ऑर्निथिन ने गैर-एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट (कुल घुलनशील फेनोलिक्स अऊर फ्लेवोनोइड्स) अऊर एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट (कैटालेज (सीएटी), पेरोक्सिडेज (पीओएक्स), अऊर पॉलीफेनोल ऑक्सीडेज (पीपीओ)) के अभिव्यक्ति का बढ़ावा दिहिस, अऊर तीन एंटीऑक्सीडेंट-संबंधित जीन (पीएसओसी, पीएसओसी, पीआरओवीडीएस, अऊर पीवीआरवीडीएस) के अभिव्यक्ति का बढ़ाइस। इसके अलावा, इन सिलिको विश्लेषण से एस. स्क्लेरोटियोरम जीनोम मा एक पुटेटिव ऑक्सालोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (एसएसओएएच) प्रोटीन के उपस्थिति का पता चला, जवन एस्परगिलस फिजिनसिस (एएफओएएच) अऊर पेनिसिलियम एसओएएच के ऑक्सालोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (एसएसओएएच) प्रोटीन से बहुत मिलत जुलत रहा। (PlOAH) कार्यात्मक विश्लेषण, संरक्षित डोमेन अऊर टोपोलॉजी के संदर्भ मा। दिलचस्प बात ई है कि आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी) माध्यम मा एल-ऑर्निथिन के जोड़े से एस. स्क्लेरोटिओरम मायसेलिया मा एसएसओएएच जीन के अभिव्यक्ति मा काफी कमी आई। इसी तरह, एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग से उपचारित पौधन से एकत्रित कवक मायसेलिया मा एसएसओएएच जीन के अभिव्यक्ति मा काफी कमी आई। अंत मा, एल-ऑर्निथिन अनुप्रयोग से पीडीबी माध्यम अऊर संक्रमित पत्तियन दुइनौ मा ऑक्सालिक एसिड स्राव मा काफी कमी आई। निष्कर्ष के तौर पर, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिति का बनाए रखै के साथ-साथ संक्रमित पौधन के रक्षा प्रतिक्रिया का बढ़ावै मा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभात है। यहि अध्ययन के परिणाम सफेद मोल्ड का नियंत्रित करै अऊर बीन उत्पादन अऊर अन्य फसलन पर ओकर प्रभाव का कम करै के लिए अभिनव, पर्यावरण के अनुकूल तरीका विकसित करै मा मदद कर सकत हैं।
सफेद मोल्ड, नेक्रोट्रॉफिक कवक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम (लिब.) डी बैरी के कारण होत है, एक विनाशकारी, उपज कम करै वाली बीमारी है जवन वैश्विक बीन (फेसियोलस वल्गरिस एल.) उत्पादन के लिए एक गंभीर खतरा पैदा करत है (बोल्टन एट अल., 2006)। स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम नियंत्रित करै के लिए सबसे कठिन मिट्टी-जनित कवक पौधा रोगजनकों में से एक है, जेहिमा 600 से अधिक पौधा प्रजातियन के एक व्यापक मेजबान श्रृंखला अऊर एक गैर-विशिष्ट तरीका से मेजबान ऊतकों का तेजी से मैसेरेट करै के क्षमता है (लियांग अऊर रोलिंस, 2018)। प्रतिकूल परिस्थितियन मा, ई अपने जीवन चक्र के एक महत्वपूर्ण चरण से गुजरत है, जवन मिट्टी मा 'स्क्लेरोटिया' नामक काला, कठोर, बीज जइसन संरचना के रूप मा या संक्रमित पौधन के मायसेलियम या तने के गड्ढा मा सफेद, शराबी वृद्धि के रूप मा लंबे समय तक सुप्त रहत है (श्वार्ट्ज एट अल।, 2005)। एस. स्क्लेरोटिओरम स्क्लेरोटिया बनावै में सक्षम है, जवन ओका संक्रमित क्षेत्रन मा लंबे समय तक जीवित रहय अऊर बीमारी के दौरान बना रहय के अनुमति देत है (श्वार्ट्ज एट अल., 2005)। स्क्लेरोटिया पोषक तत्वन से भरपूर होत हैं, लंबे समय तक मिट्टी मा रह सकत हैं, अऊर बाद के संक्रमणन के लिए प्राथमिक टीकाकरण के रूप मा काम करत हैं (श्वार्ट्ज एट अल।, 2005)। अनुकूल परिस्थितियन मा, स्क्लेरोटिया अंकुरित होत हैं अऊर हवा मा बीजाणु पैदा करत हैं जवन पौधा के जमीन के ऊपर के सब हिस्सान का संक्रमित कइ सकत हैं, जेहिमा फूल, तना या फली शामिल हैं, लेकिन इ तक सीमित नाहीं हैं (श्वार्ट्ज एट अल।, 2005)।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम अपने मेजबान पौधन का संक्रमित करै के लिए एक बहु-स्तरीय रणनीति का उपयोग करत है, जेहिमा स्क्लेरोटियल अंकुरण से लक्षण विकास तक समन्वित घटनाओं के एक श्रृंखला शामिल है। शुरुआत मा, एस. स्क्लेरोटिओरम एपोथेसिया नामक मशरूम जइसन संरचना से निलंबित बीजाणु (जेका एस्कोस्पोर कहा जात है) पैदा करत है, जवन हवा मा उड़ जात है अऊर संक्रमित पौधा के मलबा पर गैर-गतिशील स्क्लेरोटिया मा विकसित होत है (बोल्टन एट अल।, 2006)। कवक तब पौधा कोशिका भित्ति पीएच का नियंत्रित करै, एंजाइमी अपघटन अऊर ऊतक आक्रमण का बढ़ावा देय (हेगेडस अऊर रिमर, 2005) अऊर मेजबान पौधा के ऑक्सीडेटिव विस्फोट का दबावै के लिए ऑक्सालिक एसिड, एक विषाणु कारक का स्राव करत है। ई अम्लीकरण प्रक्रिया पौधा कोशिका भित्ति का कमजोर करत है, जवन फंगल कोशिका भित्ति अपघटन एंजाइम (सीडब्ल्यूडीई) के सामान्य अऊर कुशल संचालन के लिए एक अनुकूल वातावरण प्रदान करत है, जेहिसे रोगजनक भौतिक बाधा का दूर कर सकत है अऊर मेजबान ऊतकों मा प्रवेश कर सकत है (मार्सियानो एट अल।, 1983)। एक बार घुस जाय के बाद, एस. स्क्लेरोटिओरम कईयो सीडब्ल्यूडीई का स्राव करत है, जइसे कि पॉलीगैलेक्टुरोनेज अऊर सेल्यूलेज, जवन संक्रमित ऊतकों मा एकर प्रसार का सुविधाजनक बनावत हैं अऊर ऊतक परिगलन का कारण बनत हैं। घाव अऊर हाइफल मैट के प्रगति से सफेद मोल्ड के विशिष्ट लक्षण पैदा होत हैं (हेगेडस अऊर रिमर, 2005)। यहि बीच, मेजबान पौधा पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (पीआरआर) के माध्यम से रोगजनक-संबंधित आणविक पैटर्न (पीएएमपी) का पहचानत हैं, जेसे संकेतन घटनाओं के एक श्रृंखला शुरू होत है जवन अंततः रक्षा प्रतिक्रियाओं का सक्रिय करत है।
दशकन से रोग नियंत्रण प्रयासन के बावजूद, रोगजनक के प्रतिरोध, अस्तित्व अऊर अनुकूलन क्षमता के कारण, अन्य वाणिज्यिक फसलन के तरह, बीन मा पर्याप्त प्रतिरोधी जर्मप्लाज्म के कमी बनी हुई है। यहिसे रोग प्रबंधन बहुत चुनौतीपूर्ण है अऊर एक एकीकृत, बहुआयामी रणनीति के जरूरत है जेहिमा सांस्कृतिक प्रथा, जैविक नियंत्रण अऊर रासायनिक कवकनाशी (ओ'सुलिवन एट अल., 2021) का संयोजन शामिल है। सफेद मोल्ड का रासायनिक नियंत्रण सबसे प्रभावी है काहे से कि कवकनाशी, जब सही अऊर सही समय पर लगावा जात है, तौ बीमारी के फैलाव का प्रभावी ढंग से नियंत्रित कइ सकत है, संक्रमण के गंभीरता का कम कइ सकत है अऊर उपज के नुकसान का कम कइ सकत है। हालांकि, कवकनाशी पर अत्यधिक उपयोग अऊर अत्यधिक निर्भरता एस. स्क्लेरोटिओरम के प्रतिरोधी उपभेदन के उद्भव का जन्म दे सकत है अऊर गैर-लक्ष्य जीवन, मिट्टी के स्वास्थ्य अऊर पानी के गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव डाल सकत है (ले कोइंट एट अल।, 2016; सेरेसिनी एट अल।, 2024)। यहिसे, पर्यावरण के अनुकूल विकल्पन का ढूंढब एक सर्वोच्च प्राथमिकता बन गै है।
पॉलीअमाइन (पीए), जइसे कि पुट्रेसिन, स्पर्मिडिन, स्पर्मिन अऊर कैडेवरिन, मिट्टी से पैदा होय वाले पौधा रोगजनकन के खिलाफ आशाजनक विकल्प के रूप मा काम कर सकत हैं, जेहिसे खतरनाक रासायनिक कवकनाशी के उपयोग का पूरा या आंशिक रूप से कम कीन जा सकत है (नेहेला एट अल।, 2024; यी एट अल।, 2024)। उच्च पौधन मा, पीए कईयो शारीरिक प्रक्रियाओं मा शामिल होत हैं, जेहिमा कोशिका विभाजन, भेदभाव अऊर अजैविक अऊर जैविक तनाव के प्रतिक्रिया शामिल हैं, लेकिन इ तक सीमित नाहीं हैं (किलिनी अऊर नेहेला, 2020)। उ एंटीऑक्सीडेंट के रूप मा काम कर सकत हैं, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (आरओएस) का सफाई करै मा मदद कर सकत हैं, रेडॉक्स होमियोस्टेसिस (नेहेला अऊर किलिनी, 2023) का बनाए रख सकत हैं, रक्षा से संबंधित जीन (रोमेरो एट अल., 2018) का प्रेरित कर सकत हैं, विभिन्न चयापचय मार्गन का नियंत्रित कर सकत हैं (नेहेला अऊर किलिनी, 2023), एनहोरोमोन अऊर नेहोरोमोन का संशोधित कर सकत हैं (नेहेला किलिनी, 2019), प्रणालीगत अधिग्रहित प्रतिरोध (एसएआर) स्थापित करत हैं, अऊर पौधा-रोगजनक परस्पर क्रियाओं का नियंत्रित करत हैं (नेहेला अऊर किलिनी, 2020; असीजा एट अल।, 2022; चेरवोनिएक, 2022)। ई ध्यान देय लायक है कि पौधा रक्षा मा पीए के विशिष्ट तंत्र अऊर भूमिका पौधा प्रजाति, रोगजनक अऊर पर्यावरणीय परिस्थितियन के आधार पर भिन्न होत हैं। पौधन मा सबसे अधिक प्रचुर मात्रा मा पीए आवश्यक पॉलीअमाइन एल-ऑर्निथिन (किलिनी अऊर नेहेला, 2020) से जैव संश्लेषण कीन जात है।
एल-ऑर्निथिन पौधा के विकास अऊर विकास मा कईयो भूमिका निभात है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनन से पता चला है कि चावल (ओरिजा सैटिवा) मा, ऑर्निथिन नाइट्रोजन पुनर्चक्रण (लियू एट अल।, 2018), चावल के उपज, गुणवत्ता अऊर सुगंध (लू एट अल।, 2020), अऊर जल तनाव प्रतिक्रिया (यांग एट अल।, 2000) से जुड़ा हो सकत है। इसके अलावा, एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग ने चीनी बीट (बीटा वल्गरिस) (हुसैन एट अल।, 2019) में सूखा सहिष्णुता में काफी वृद्धि की और प्याज (एलियम सेपा) में नमक तनाव को कम किया (Çavuşoǧlu और Çavuşoǧlu, 2021) और काशेडियम पौधा (अवुशोडेंट) रोचा एट अल., 2012). अजैविक तनाव रक्षा मा एल-ऑर्निथिन के संभावित भूमिका उपचारित पौधन मा प्रोलिन संचय मा ओकर भागीदारी के कारण हो सकत है। उदाहरण के लिए, प्रोलिन चयापचय से संबंधित जीन, जइसे कि ऑर्निथिन डेल्टा एमिनोट्रांसफ़ेरेज (डेल्टा-ओएटी) अऊर प्रोलिन डिहाइड्रोजेनेज (प्रोडीएच 1 अऊर प्रोडीएच 2) जीन, पहिले गैर-मेजबान स्यूडोमोनास सिरिंग उपभेदों (एस-एस अऊर मायसोरिंग) के खिलाफ निकोटियाना बेंथामियाना अऊर अरबिडोप्सिस थालियाना के बचाव मा शामिल होए के सूचना मिली है। 2012)। दूसर ओर, रोगजनक वृद्धि (सिंह एट अल., 2020) के लिए फंगल ऑर्निथिन डिकार्बोक्सिलेज (ओडीसी) के आवश्यकता होत है। फ्यूसेरियम ऑक्सीस्पोरम एफ के ओडीसी का लक्ष्य बनावै। एसपी मेजबान-प्रेरित जीन साइलेंसिंग (एचआईजीएस) के माध्यम से लाइकोपर्सिसी ने टमाटर के पौधों के फुसेरियम विल्ट (सिंह एट अल।, 2020) के प्रतिरोध को काफी बढ़ाया। हालांकि, फाइटोपैथोजेन जइसन जैविक तनाव के खिलाफ बहिर्जात ऑर्निथिन अनुप्रयोग के संभावित भूमिका का अच्छी तरह से अध्ययन नाहीं कीन गा है। जादा महत्वपूर्ण बात ई है कि रोग प्रतिरोध अऊर संबंधित जैव रासायनिक अऊर शारीरिक घटनाओं पर ऑर्निथिन के प्रभाव काफी हद तक अनजान हैं।
फलियन के एस. स्क्लेरोटिओरम संक्रमण के जटिलता का समझब प्रभावी नियंत्रण रणनीतियन के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। यहि अध्ययन मा, हम स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम संक्रमण के प्रति फलियन के पौधन के रक्षा तंत्र अऊर प्रतिरोध का बढ़ावै मा एक प्रमुख कारक के रूप मा डायमिन एल-ऑर्निथिन के संभावित भूमिका के पहचान करै का लक्ष्य रखेन। हम परिकल्पना करत हैं कि, संक्रमित पौधन के रक्षा प्रतिक्रियाओं का बढ़ावै के अलावा, एल-ऑर्निथिन रेडॉक्स स्थिति का बनाए रखै मा भी एक प्रमुख भूमिका निभात है। हम प्रस्तावित करत हैं कि एल-ऑर्निथिन के संभावित प्रभाव एंजाइमी अऊर गैर-एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के विनियमन अऊर फंगल रोगजनकता/विषाणु कारक अऊर संबंधित प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप से संबंधित हैं। एल-ऑर्निथिन के ई दोहरी कार्यक्षमता ईका सफेद मोल्ड के प्रभाव का कम करै अऊर ई शक्तिशाली फंगल रोगजनक के प्रति आम फलियन के फसलन के प्रतिरोध का बढ़ावै के लिए एक टिकाऊ रणनीति के लिए एक आशाजनक उम्मीदवार बनावत है। वर्तमान अध्ययन के परिणाम सफेद मोल्ड का नियंत्रित करै अऊर फलियन के उत्पादन पर ओकर प्रभाव का कम करै के लिए अभिनव, पर्यावरण के अनुकूल तरीकन के विकास मा मदद कर सकत हैं।
यहि अध्ययन मा, आम बीन, गीजा 3 (फेसियोलस वल्गरिस एल. सीवी. गीजा 3) के एक संवेदनशील वाणिज्यिक किस्म का प्रयोगात्मक सामग्री के रूप मा उपयोग कीन गा रहा। स्वस्थ बीज फलियां अनुसंधान विभाग, फील्ड फसल अनुसंधान संस्थान (एफसीआरआई), कृषि अनुसंधान केंद्र (एआरसी), मिस्र द्वारा दयालुता से प्रदान कीन गा रहें। ग्रीनहाउस परिस्थितियन (25 ± 2 °C, सापेक्ष आर्द्रता 75 ± 1%, 8 घंटा रोशनी/16 घंटा अंधेरा) मा एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित मिट्टी से भरे प्लास्टिक के बर्तन (आंतरिक व्यास 35 सेमी, गहराई 50 सेमी) मा पांच बीज बोवा गा रहा। बुवाई (डीपीएस) के 7-10 दिन बाद, रोपाई का पतला कर दीन गा रहा ताकि हर गमले मा एक समान वृद्धि के साथ केवल दुई रोपाई अऊर तीन पूरी तरह से विस्तारित पत्तियन का छोड़ा जा सके। सब गमले के पौधन का हर दुइ हफ्ता मा एक बार पानी पिलावा जात रहा अऊर दिये गये किस्म के लिए अनुशंसित दर से हर महीना निषेचित कीन जात रहा।
एल-ऑर्निथिनडायमाइन (जेका (+)-(एस)-2,5-डायमिनोपेन्टेनोइक एसिड के रूप मा भी जाना जात है; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टैड, जर्मनी) के 500 मिलीग्राम/एल सांद्रता तैयार करै के लिए, 50 मिलीग्राम का पहिले 100 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल मा घुलावा गा रहा। तब स्टॉक घोल का पतला कीन गा अऊर बाद के प्रयोगन मा उपयोग कीन गा। संक्षेप मा, एल-ऑर्निथिन सांद्रता (12.5, 25, 50, 75, 100, अऊर 125 मिलीग्राम/एल) के छह श्रृंखला इन विट्रो मा परीक्षण कीन गा रहा। यहिके अलावा, बाँझ आसुत जल का नकारात्मक नियंत्रण (मॉक) के रूप मा उपयोग कीन गा रहा अऊर वाणिज्यिक कवकनाशी "रिजोलेक्स-टी" 50% गीला पाउडर (टोक्लोफोस-मिथाइल 20% + थिराम 30%; केजेड-काफर एल ज़ायत कीटनाशक अऊर रसायन कंपनी, काफर अल ज़ायत, गर्बिया गवर्नर, ईग) का सकारात्मक नियंत्रण के रूप मा उपयोग कीन गा रहा। वाणिज्यिक कवकनाशी "रिजोलेक्स-टी" का पांच सांद्रता (2, 4, 6, 8 अऊर 10 मिलीग्राम/एल) मा इन विट्रो मा परीक्षण कीन गा रहा।
आम बीन के तने अऊर फली के नमूना जवन सफेद मोल्ड (आक्रमण दर: 10-30%) के विशिष्ट लक्षण देखावत हैं, वाणिज्यिक खेतन से एकत्रित कीन गा रहें। यद्यपि संक्रमित पौधा सामग्री मा से अधिकांश प्रजाति/किस्म (संवेदनशील वाणिज्यिक किस्म गीजा 3) द्वारा पहचाना गा रहा, लेकिन दूसर, खासकर स्थानीय बाजारन से प्राप्त, अज्ञात प्रजाति के रहे। एकत्रित संक्रमित सामग्री का पहिले 3 मिनट के लिए 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट घोल से सतह कीटाणुरहित कीन गा रहा, फिर बाँझ आसुत जल से कई बार कुल्ला कीन गा रहा अऊर अतिरिक्त पानी का हटावै के लिए बाँझ फिल्टर पेपर से सूखा पोंछा गा रहा। तब संक्रमित अंगन का बीच के ऊतक (स्वस्थ अऊर संक्रमित ऊतकों के बीच) से छोटे टुकड़न मा काटा गा रहा, आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए) माध्यम पर संवर्धित कीन गा रहा अऊर स्क्लेरोटिया के गठन का उत्तेजित करै के लिए 5 दिन के लिए 12 घंटा के प्रकाश / 12 घंटा के अंधेरे चक्र के साथ 25 ± 2 °C पर ऊष्मायन करा गा रहा। मिश्रित या दूषित संस्कृतियन से फंगल आइसोलेट का शुद्ध करै के लिए मायसेलियल टिप विधि का भी उपयोग कीन गा रहा। शुद्ध फंगल आइसोलेट का पहिले ओकर सांस्कृतिक रूपात्मक विशेषता के आधार पर पहचाना गा रहा अऊर फिर सूक्ष्म विशेषता के आधार पर एस. स्क्लेरोटिओरम होए के पुष्टि कीन गा रहा। अंत मा, कोच के सिद्धांतन का पूरा करै के लिए संवेदनशील आम बीन किस्म गीजा 3 पर रोगजनकता के लिए सब शुद्ध आइसोलेट का परीक्षण कीन गा रहा।
यहिके अलावा, व्हाइट एट अल., 1990 द्वारा वर्णित आंतरिक प्रतिलेखित स्पेसर (आईटीएस) अनुक्रमण के आधार पर सबसे आक्रामक एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट (आइसोलेट # 3) का आगे पुष्टि कीन गै रही; बटुरो-सिसनिव्स्का एट अल., 2017. संक्षेप मा, आइसोलेट का आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी) मा संवर्धित कीन गा रहा अऊर 5-7 दिन के लिए 25 ± 2 °C पर ऊष्मायन करा गा रहा। फिर फंगल मायसेलियम एकत्र कीन गा रहा, चीज़क्लॉथ से छाना गा रहा, बाँझ पानी से दुइ बार धोवा गा रहा, अऊर बाँझ फिल्टर पेपर से सुखावा गा रहा। जीनोमिक डीएनए का क्विक-डीएनए TM फंगल/बैक्टीरियल मिनीप्रेप किट (कुरामे-इज़िओका, 1997; अटाल्ला एट अल।, 2022, 2024) का उपयोग कइके अलग कीन गा रहा। तब आईटीएस आरडीएनए क्षेत्र का विशिष्ट प्राइमर जोड़ी आईटीएस 1/आईटीएस 4 (टीसीसीजीटीएजीजीएएसीसीटीजीसीजीजी टीसीसीटीसीजीसीटीटीएटीटीजीएटीजीसी; अपेक्षित आकार: 540 बीपी) (बटुरो-सिसनिव्स्का एट अल।, 2017) का उपयोग कइके प्रवर्धित कीन गा रहा। शुद्ध पीसीआर उत्पादन का अनुक्रमण (बीजिंग आओके डिंगशेंग बायोटेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड) के लिए प्रस्तुत कीन गा रहा। आईटीएस आरडीएनए अनुक्रमन का सेंगर अनुक्रमण विधि का उपयोग कइके द्वि-दिशात्मक रूप से अनुक्रमित कीन गा रहा। इकट्ठा कीन गा क्वेरी अनुक्रमन का तब BLASTn सॉफ्टवेयर का उपयोग कइके जेनबैंक अऊर नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इन्फॉर्मेशन (एनसीबीआई, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) मा नवीनतम डेटा से तुलना कीन गै। क्वेरी अनुक्रम के तुलना एनसीबीआई जेनबैंक (पूरक तालिका एस 1) मा नवीनतम डेटा से पुनः प्राप्त 20 अन्य एस. स्क्लेरोटिओरम उपभेदों / आइसोलेट्स के साथ आणविक विकासवादी आनुवंशिकी विश्लेषण पैकेज (मेगा -11; संस्करण 11) (कुमार एट अल।, 2024) मा क्लस्टलडब्ल्यू का उपयोग करत हुए कीन गा रहा। विकासवादी विश्लेषण अधिकतम संभावना विधि अऊर सामान्य समय-उलट न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन मॉडल (नी अऊर कुमार, 2000) का उपयोग कइके कीन गा रहा। सबसे अधिक लॉग-संभावना वाला पेड़ देखावा गा है। अनुमानी खोज के लिए प्रारंभिक पेड़ का चयन पड़ोसी-जुड़ने (एनजे) पेड़ (कुमार एट अल., 2024) अऊर अधिकतम पारसीमोनी (एमपी) पेड़ के बीच उच्च लॉग-संभावना वाले पेड़ का चयन कइके कीन जात है। एनजे पेड़ का निर्माण सामान्य समय-उलट मॉडल (नी अऊर कुमार, 2000) का उपयोग कइके गणना कीन गा एक जोड़ीवार दूरी मैट्रिक्स का उपयोग कइके कीन गा रहा।
एल-ऑर्निथिन अऊर जीवाणुनाशक "रिजोलेक्स-टी" के जीवाणुरोधी गतिविधि अगर प्रसार विधि से इन विट्रो मा निर्धारित कीन गा रहा। विधि: एल-ऑर्निथिन (500 मिलीग्राम/एल) के स्टॉक घोल के उचित मात्रा लीन जाय अऊर क्रमशः 12.5, 25, 50, 75, 100 अऊर 125 मिलीग्राम/एल के अंतिम सांद्रता के साथ घोल तैयार करै के लिए पीडीए पोषक तत्व माध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से मिलावा जाय। कवकनाशी "रिजोलेक्स-टी" (2, 4, 6, 8 अऊर 10 मिलीग्राम/लीटर) अऊर बाँझ आसुत जल के पांच सांद्रता का नियंत्रण के रूप मा उपयोग कीन गा रहा। माध्यम के ठोस होए के बाद, स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम संस्कृति का एक ताजा तैयार मायसेलियल प्लग, 4 मिमी व्यास का, पेट्री डिश के केंद्र मा स्थानांतरित कीन गा अऊर 25 ± 2°C पर तब तक संवर्धित कीन गा जब तक कि मायसेलियम पूरे नियंत्रण पेट्री डिश का ढँक न ले, जेकरे बाद कवक वृद्धि दर्ज कीन गा। समीकरण 1 का उपयोग कइके एस. स्क्लेरोटिओरम के रेडियल विकास के प्रतिशत निषेध के गणना करा:
प्रयोग का दुइ बार दोहरावा गा रहा, जेहिमा हर नियंत्रण/प्रायोगिक समूह के लिए छह जैविक प्रतिकृति अऊर हर जैविक प्रतिकृति के लिए पांच बर्तन (प्रति बर्तन दुई पौधा) शामिल रहे। प्रयोगात्मक परिणामन के सटीकता, विश्वसनीयता अऊर प्रतिलिपि प्रस्तुत करै के सुनिश्चित करै के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति का दुई बार (दुई तकनीकी प्रतिकृति) विश्लेषण कीन गा रहा। यहिके अलावा, आधा-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (IC50) अऊर IC99 (प्रेंटिस, 1976) के गणना करै के लिए प्रोबिट प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग कीन गा रहा।
ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा एल-ऑर्निथिन के क्षमता का मूल्यांकन करै के लिए, लगातार दुई पॉट प्रयोग कीन गा रहें। संक्षेप मा, बर्तनन का निष्फल मिट्टी-रेत के मिट्टी (3:1) से भरा गा रहा अऊर एस. स्क्लेरोटियोरम के ताजा तैयार संस्कृति से टीका लगावा गा रहा। सबसे पहिले, एस. स्क्लेरोटिओरम (आइसोलेट #3) के सबसे आक्रामक आइसोलेट का एक स्क्लेरोटियम का आधा काट के, एक पीडीए पर मुँह नीचे रख के अऊर मायसेलियम के विकास का उत्तेजित करै के लिए 4 दिन तक लगातार अंधेरे (24 घंटा) मा 25°C पर ऊष्मायन कइके संवर्धित कीन गा रहा। फिर चार 5 मिमी व्यास के अगर प्लग का अग्रणी किनारे से लिया गा अऊर गेहूं अऊर चावल के चोकर (1:1, v/v) के 100 ग्राम बाँझ मिश्रण से टीका लगावा गा अऊर सब फ्लास्क का 25 ± 2 °C पर 12 घंटा के रोशनी/12 घंटा के अंधेरे चक्र के तहत 5 दिन के लिए ऊष्मायन करा गा ताकि चक्र के गठन का उत्तेजित कीन जा सके। मिट्टी डारै से पहिले एकरूपता सुनिश्चित करै के लिए सब फ्लास्क के सामग्री का अच्छी तरह से मिलावा गा रहा। फिर, रोगजनकन के निरंतर एकाग्रता सुनिश्चित करै के लिए हर बर्तन मा 100 ग्राम उपनिवेश चोकर मिश्रण डाला गा रहा। टीका लगावा गा बर्तनन का कवक के विकास का सक्रिय करै के लिए पानी पिलावा गा अऊर 7 दिन के लिए ग्रीनहाउस के स्थिति मा रखा गा।
तब हर गमले मा गीजा 3 किस्म के पांच बीज बोवा गा रहा। एल-ऑर्निथिन अऊर कवकनाशी रिजोलेक्स-टी से उपचारित बर्तनन के लिए, निष्फल बीजन का पहिले दुइ यौगिकन के जलीय घोल मा क्रमशः लगभग 250 मिलीग्राम/लीटर अऊर 50 मिलीग्राम/लीटर के अंतिम आईसी99 सांद्रता के साथ दुई घंटा तक भिगोवा गा रहा, अऊर फिर बुवाई से पहिले एक घंटा के लिए हवा मा सुखावा गा रहा। दूसर ओर, बीज का नकारात्मक नियंत्रण के रूप मा बाँझ आसुत जल मा भिगोवा गा रहा। दस दिन बाद, पहिला पानी देय से पहिले, अंकुरन का पतला कइ दीन गा रहा, जेहिसे हर बर्तन मा केवल दुई साफ-सुथरा अंकुर बचे रहे। इसके अलावा, एस. स्क्लेरोटिओरम के साथ संक्रमण सुनिश्चित करै के लिए, एक ही विकासात्मक चरण (10 दिन) मा बीन पौधा के तने का एक निष्फल स्केलपेल का उपयोग कइके दुई अलग-अलग स्थानन पर काटा गा रहा अऊर लगभग 0.5 ग्राम उपनिवेशित चोकर मिश्रण का प्रत्येक घाव मा रखा गा रहा, जेकरे बाद संक्रमण का उत्तेजित करै के लिए उच्च आर्द्रता अऊर संक्रमित सब पौधा के विकास का संक्रमित कीन गा रहा। नियंत्रण पौधन का समान रूप से घायल कीन गा रहा अऊर घाव मा बाँझ, अउपनिवेशित चोकर मिश्रण के बराबर मात्रा (0.5 ग्राम) रखा गा रहा अऊर रोग के विकास के लिए वातावरण का अनुकरण करै अऊर उपचार समूहन के बीच स्थिरता सुनिश्चित करै के लिए उच्च आर्द्रता के तहत बनाए रखा गा रहा।
उपचार विधि: बीन के अंकुरन का मिट्टी का सिंचाई कइके एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/लीटर) या कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (50 मिलीग्राम/लीटर) के जलीय घोल के 500 मिलीलीटर से पानी पिलावा गा रहा, फिर 10 दिन के अंतराल पर तीन बार उपचार दोहरावा गा रहा। प्लेसबो-उपचारित नियंत्रणन का 500 मिलीलीटर बाँझ आसुत जल से सिंचित कीन गा रहा। सब उपचार ग्रीनहाउस परिस्थितियन (25 ± 2°C, 75 ± 1% सापेक्ष आर्द्रता, अऊर 8 घंटा रोशनी/16 घंटा अंधेरा) के फोटोपीरियड मा कीन गा रहें। विशिष्ट किस्म अऊर निर्माण के निर्देशन के सिफारिशन के अनुसार पर्ण छिड़काव द्वारा 3-4 ग्राम/एल के सांद्रता मा सब बर्तनन का पखवाड़ा मा पानी पिलावा जात रहा अऊर संतुलित एनपीके उर्वरक (20-20-20, 3.6% सल्फर अऊर टीई सूक्ष्म तत्वन के साथ; जैन सीड्स, मिस्र) के साथ मासिक इलाज कीन जात रहा। जब तक अन्यथा न कहा जाय, तब तक पूरी तरह से विस्तारित परिपक्व पत्ते (ऊपर से दूसरा अऊर तीसरा पत्ता) 72 घंटा बाद के उपचार (एचपीटी) मा प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से एकत्रित कीन गा रहें, समरूप बनावा गा रहें, पूल कीन गा रहें अऊर आगे के विश्लेषण के लिए -80 °C पर संग्रहीत कीन गा रहें, जेहिमा ऑक्सीडेटिव तनाव संकेतक, लिपॉक्सीडेटिक संकेतक, लिपॉक्सीडेटिक अऊर एनजाइड के इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण शामिल रहें, लेकिन इ तक सीमित नाहीं रहें। गैर-एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट अऊर जीन अभिव्यक्ति।
टेरन एट अल द्वारा संशोधित पेट्जोल्ड अऊर डिक्सन पैमाने (1996) के आधार पर 1-9 (पूरक तालिका एस 2) के पैमाने का उपयोग कइके सफेद मोल्ड संक्रमण तीव्रता का साप्ताहिक 21 दिन बाद टीकाकरण (डीपीआई) का आकलन कीन गा रहा। (2006). संक्षेप मा, इंटरनोड्स अऊर नोड्स के साथ घाव के प्रगति का पालन करै के लिए टीकाकरण के बिंदु से शुरू कइके बीन पौधन के तना अऊर शाखाओं के जांच कीन गै रही। तब टीकाकरण के बिंदु से तना या शाखा के साथ सबसे दूर के बिंदु तक घाव के दूरी का मापा गा रहा अऊर घाव के स्थान के आधार पर 1-9 का स्कोर सौंपा गा रहा, जहां (1) टीकाकरण के बिंदु के पास कौनो दृश्यमान संक्रमण का संकेत दिहिस अऊर (2-9) घाव के आकार अऊर प्रगति मा धीरे-धीरे वृद्धि का संकेत दिहिस (S2) नोड्स/अंतर नोड्स (पूरक तालिका S2)। तब सूत्र 2 का उपयोग कइके सफेद मोल्ड संक्रमण तीव्रता का प्रतिशत मा बदला गा रहा:
यहिके अलावा, रोग प्रगति वक्र (एयूडीपीसी) के तहत क्षेत्र के गणना सूत्र (शैनर अऊर फिनी, 1977) का उपयोग कइके कीन गा रहा, जेका हाल ही मा समीकरण 3 का उपयोग कइके आम बीन (चौहान एट अल., 2020) के सफेद सड़ांध के लिए अनुकूलित कीन गा रहा:
जहाँ Yi = समय ti पर रोग गंभीरता, Yi+1 = अगले समय ti+1 पर रोग गंभीरता, ti = पहिला माप का समय (दिन मा), ti+1 = अगले माप का समय (दिन मा), n = समय बिंदु या अवलोकन बिंदु के कुल संख्या। पौधा के ऊंचाई (सेमी), प्रति पौधा शाखाओं के संख्या अऊर प्रति पौधा पत्तियन के संख्या सहित बीन पौधा के विकास पैरामीटर सब जैविक प्रतिकृतियन मा 21 दिन तक साप्ताहिक रूप से दर्ज कीन गा रहें।
हर जैविक प्रतिकृति मा, पत्ता के नमूना (ऊपर से दूसर अऊर तीसरा पूरा तरह से विकसित पत्ता) उपचार के बाद 45 वें दिन (अंतिम उपचार के 15 दिन बाद) एकत्रित कीन गा रहें। हर जैविक प्रतिकृति मा पाँच बर्तन (प्रति बर्तन मा दुई पौधा) शामिल रहे। कुचल ऊतक के लगभग 500 मिलीग्राम का उपयोग अंधेरे मा 4 °C पर 80% एसीटोन का उपयोग कइके प्रकाश संश्लेषक वर्णक (क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी अऊर कैरोटीनॉयड्स) के निष्कर्षण के लिए कीन गा रहा। घंटे के बाद, नमूना सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहें अऊर सुपरनेटेंट का क्लोरोफिल ए, क्लोरोफिल बी अऊर कैरोटीनॉयड सामग्री के निर्धारण के लिए यूवी-160 ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके (लिचटेन्थलर, 1987) के विधि के अनुसार तीन अलग-अलग तरंगन के अवशोषण से एकत्रित कीन गा रहा। (ए470, ए646 अऊर ए663 एनएम)। अंत मा, लिचटेनथलर (1987) द्वारा वर्णित निम्नलिखित सूत्र 4-6 का उपयोग कइके प्रकाश संश्लेषक वर्णक के सामग्री के गणना कीन गै रही।
उपचार (एचपीटी) के 72 घंटा बाद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2) अऊर सुपरऑक्साइड आयन (ओ 2 • -) के इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से पत्तियन (ऊपर से दूसर अऊर तीसर पूरी तरह से विकसित पत्तियन) एकत्र कीन गा रहें। हर जैविक प्रतिकृति मा पाँच बर्तन (प्रति बर्तन मा दुई पौधा) शामिल रहे। विधि के सटीकता, विश्वसनीयता अऊर प्रतिलिपि प्रस्तुत करै के सुनिश्चित करै के लिए हर जैविक प्रतिकृति का डुप्लिकेट (दुई तकनीकी प्रतिकृति) मा विश्लेषण कीन गा रहा। H2O2 अऊर O2•− का निर्धारण क्रमशः 0.1% 3,3′-डायमिनोबेन्जिडीन (डीएबी; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टैड, जर्मनी) या नाइट्रोब्लू टेट्राजोलियम (एनबीटी; सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टैड, जर्मनी) का उपयोग कइके कीन गा रहा, रोमेरो-प्यूर्टास एट अल द्वारा वर्णित विधियन का पालन करत हुए। (2004) अऊर एडम एट अल। (1989) मामूली संशोधनन के साथ। H2O2 के हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए, पत्रिकाओं का 10 एमएम ट्रिस बफर (पीएच 7.8) मा 0.1% डीएबी के साथ वैक्यूम घुसपैठ कीन गा रहा अऊर फिर 60 मिनट के लिए रोशनी मा कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा रहा। पत्रिकाओं का 4:1 (v/v) इथेनॉल:क्लोरोफॉर्म (अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाईज, काहिरा, मिस्र) मा 0.15% (v/v) टीसीए मा विरंजित कीन गा रहा अऊर फिर तब तक रोशनी के संपर्क मा रखा गा रहा जब तक कि उ अंधेरा न होइ जाय। इसी तरह, वाल्व का 10 एमएम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच 7.8) के साथ वैक्यूम घुसपैठ कीन गा रहा, जेहिमा O2•− के हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण के लिए 0.1 w/v % HBT रहा। पत्रिकाओं का कमरा के तापमान पर 20 मिनट के लिए रोशनी मा ऊष्मायन करा गा रहा, फिर ऊपर के रूप मा विरंजित कीन गा रहा, अऊर फिर तब तक रोशन कीन गा रहा जब तक कि गहरा नीला / बैंगनी धब्बा दिखाई न दे। परिणामी भूरे (एक H2O2 संकेतक के रूप मा) या नीले-बैंगनी (एक O2•− संकेतक के रूप मा) रंग के तीव्रता का आकलन छवि प्रसंस्करण पैकेज ImageJ (http://fiji.sc; 7 मार्च 2024 का पहुँचा) के फिजी संस्करण का उपयोग कइके कीन गा रहा।
मालोन्डियाल्डिहाइड (एमडीए; लिपिड पेरोक्सिडेशन के मार्कर के रूप मा) का निर्धारण डू अऊर ब्रैमलेज (1992) के विधि के अनुसार थोड़े संशोधन के साथ कीन गा रहा। हर जैविक प्रतिकृति (ऊपर से दूसरा अऊर तीसरा पूरा तरह से विकसित पत्ता) से पत्तियन का 72 घंटा बाद उपचार (एचपीटी) एकत्र कीन गा रहा। हर जैविक प्रतिकृति मा पाँच बर्तन (प्रति बर्तन मा दुई पौधा) शामिल रहे। विधि के सटीकता, विश्वसनीयता अऊर प्रतिलिपि प्रस्तुत करै के सुनिश्चित करै के लिए हर जैविक प्रतिकृति का डुप्लिकेट (दुई तकनीकी प्रतिकृति) मा विश्लेषण कीन गा रहा। संक्षेप मा, 0.5 ग्राम ग्राउंड लीफ टिशू का उपयोग 20% ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड (टीसीए; मिलीपोरसिग्मा, बर्लिंगटन, एमए, यूएसए) के साथ एमडीए निष्कर्षण के लिए कीन गा रहा, जेहिमा 0.01% ब्यूटाइलेटेड हाइड्रोक्सीटोल्यून (बीएचटी; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) रहा। तब सुपरनेटेंट मा एमडीए सामग्री का यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके 532 अऊर 600 एनएम पर अवशोषण का माप के वर्णमिति रूप से निर्धारित कीन गा रहा अऊर फिर एनएमओएल जी-1 एफडब्ल्यू के रूप मा व्यक्त कीन गा रहा।
गैर-एंजाइमी अऊर एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट के आकलन के लिए, पत्तियन (ऊपर से दूसर अऊर तीसर पूरी तरह से विकसित पत्तियन) का 72 घंटा बाद के उपचार (एचपीटी) मा प्रत्येक जैविक प्रतिकृति से एकत्र कीन गा रहा। हर जैविक प्रतिकृति मा पाँच बर्तन (प्रति बर्तन मा दुई पौधा) शामिल रहे। हर जैविक नमूना का डुप्लिकेट (दुइ तकनीकी नमूना) मा विश्लेषण कीन गा रहा। दुई पत्तियन का तरल नाइट्रोजन से पीसा गा रहा अऊर सीधे एंजाइमी अऊर गैर-एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट, कुल अमीनो एसिड, प्रोलिन सामग्री, जीन अभिव्यक्ति अऊर ऑक्सालेट मात्रा निर्धारण के निर्धारण के लिए उपयोग कीन गा रहा।
कुल घुलनशील फेनोलिक का निर्धारण फोलिन-सिओकाल्ट्यू अभिकर्मक (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग कइके काहकोनेन एट अल द्वारा वर्णित विधि मा मामूली संशोधन के साथ कीन गा रहा। (1999) संक्षेप मा, लगभग 0.1 ग्राम समरूप पत्ता ऊतक का 24 घंटा के लिए अंधेरे मा 20 मिलीलीटर 80% मेथनॉल के साथ निकाला गा रहा अऊर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सुपरनेटेंट एकत्र कीन गा रहा। नमूना अर्क के 0.1 मिलीलीटर का 0.5 मिलीलीटर फोलिन-सिओकाल्ट्यू अभिकर्मक (10%) के साथ मिलावा गा रहा, 30 सेकंड के लिए हिलावा गा रहा अऊर 5 मिनट के लिए अंधेरे मा छोड़ दीन गा रहा। फिर 0.5 मिलीलीटर 20% सोडियम कार्बोनेट घोल (Na2CO3; अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाईज कंपनी, काहिरा, मिस्र) का हर ट्यूब मा जोड़ा गा, अच्छी तरह से मिलावा गा अऊर 1 घंटा के लिए अंधेरे मा कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा। ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण का यूवी-160 ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके 765 एनएम पर मापा गा रहा। नमूना अर्क मा कुल घुलनशील फिनोल के सांद्रता का निर्धारण गैलिक एसिड अंशांकन वक्र (फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) का उपयोग कइके कीन गा रहा अऊर ताजा वजन के प्रति ग्राम (मिलीग्राम जीएई जी-1 ताजा वजन) के प्रति ग्राम गैलिक एसिड समकक्ष के मिलीग्राम के रूप मा व्यक्त कीन गा रहा।
कुल घुलनशील फ्लेवोनॉइड सामग्री का निर्धारण जेरिडेन एट अल के विधि के अनुसार कीन गा रहा। (2006) थोड़े संशोधन के साथ। संक्षेप मा, उपरोक्त मेथनॉल अर्क के 0.3 मिलीलीटर का 0.3 मिलीलीटर 5% एल्यूमीनियम क्लोराइड घोल (AlCl3; फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) के साथ मिलावा गा रहा, जोर से हिलावा गा रहा अऊर फिर 5 मिनट के लिए कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा रहा, जेकरे बाद 0.3 मिलीलीटर 0.3 मिलीलीटर 5% एल्यूमीनियम क्लोराइड घोल (AlCl3; फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) के साथ मिलावा गा रहा, फिर 5 मिनट के लिए कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा रहा, जेकरे बाद 0.3 मिलीलीटर 0.3 मिलीलीटर 5% एल्यूमीनियम क्लोराइड घोल का जोड़ा गा रहा। (अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाईज, काहिरा, मिस्र), पूरी तरह से मिलावा गा अऊर अंधेरे मा 30 मिनट के लिए कमरा के तापमान पर ऊष्मायन करा गा। ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण का यूवी-160 ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके 430 एनएम पर मापा गा रहा। नमूना अर्क मा कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड्स के सांद्रता एक रुटिन अंशांकन वक्र (टीसीआई अमेरिका, पोर्टलैंड, ओआर, यूएसए) का उपयोग कइके निर्धारित कीन गा रहा अऊर फिर ताजा वजन के प्रति ग्राम रुटिन समतुल्य के मिलीग्राम के रूप मा व्यक्त कीन गा रहा (मिलीग्राम आरई जी -1 ताजा वजन)।
बीन के पत्तन के कुल मुक्त अमीनो एसिड सामग्री का निर्धारण योकोयामा अऊर हिरामत्सु (2003) द्वारा प्रस्तावित विधि के आधार पर एक संशोधित निनहाइड्रिन अभिकर्मक (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) का उपयोग कइके कीन गा रहा अऊर सन एट अल द्वारा संशोधित कीन गा रहा। (2006). संक्षेप मा, 0.1 ग्राम जमीनी ऊतक का पीएच 5.4 बफर के साथ निकाला गा रहा, अऊर 200 μL सुपरनेटेंट का 200 μL निनहाइड्रिन (2%) अऊर 200 μL पाइरिडीन (10%; स्पेक्ट्रम केमिकल, न्यू ब्रंसविक, एनजे, यूएसए) के साथ प्रतिक्रिया कीन गा रहा, उबलत पानी मा ऊष्मायन कीन गा रहा अऊर फिर 300000 मिनट के लिए ठंडा कीन गा रहा। यूवी-160ए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके 580 एनएम पर। दूसर ओर, प्रोलिन का निर्धारण बेट्स विधि (बेट्स एट अल., 1973) से कीन गा रहा। प्रोलिन का 3% सल्फोसैलिसिलिक एसिड (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) से निकाला गा रहा अऊर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सुपरनेटेंट के 0.5 मिलीलीटर का 1 मिलीलीटर ग्लेशियल एसिटिक एसिड (फिशर साइंटिफिक, हैम्पटन, एनएच, यूएसए) अऊर निनहाइड्रिन अभिकर्मक के साथ मिलावा गा रहा, जेका 90 °C पर ऊष्मायन करा गा रहा, ऊपर के समान स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कइके 520 एनएम पर मापा गा है। पत्ती के अर्क मा कुल मुक्त अमीनो एसिड अऊर प्रोलिन का क्रमशः ग्लाइसिन अऊर प्रोलिन कैलिब्रेशन वक्र (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) का उपयोग कइके निर्धारित कीन गा रहा, अऊर मिलीग्राम/जी ताजा वजन के रूप मा व्यक्त कीन गा रहा।
एंटीऑक्सीडेंट एंजाइमन के एंजाइमी गतिविधि का निर्धारित करै के लिए, लगभग 500 मिलीग्राम समरूप ऊतक का 50 एमएम ट्रिस बफर (पीएच 7.8) के 3 मिलीलीटर के साथ निकाला गा रहा जेहिमा 1 एमएम ईडीटीए-एनए 2 (सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) अऊर 7.5% पॉलीलिपाइलिलोन (पीपीएच; पीएच) शामिल रहा। सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए), प्रशीतन (4 °C) के तहत 20 मिनट के लिए 10,000 × g पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा, अऊर सुपरनेटेंट (कच्चा एंजाइम अर्क) एकत्र कीन गा रहा (एल-नागर एट अल।, 2023; उस्मान एट अल।, 2023)। तब कैटालेज (सीएटी) का 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.5; सिग्मा-एल्ड्रिच, सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) के 2 मिलीलीटर अऊर 269 एमएम एच 2 ओ 2 घोल के 100 μl के साथ प्रतिक्रिया कीन गा रहा ताकि एबी (1984) के विधि के अनुसार एकर एंजाइमी गतिविधि का निर्धारित कीन जा सके। 2023; उस्मान एट अल., 2023). गुआइकोल-निर्भर पेरोक्सिडेज (पीओएक्स) एंजाइमी गतिविधि का निर्धारण हैराच एट अल के विधि का उपयोग कइके कीन गा रहा। (2009) (2008) मामूली संशोधनन के साथ (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023) अऊर पॉलीफेनॉल ऑक्सीडेज (पीपीओ) के एंजाइमी गतिविधि 100 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.00,0 μT) के 2.2 मिलीलीटर के साथ प्रतिक्रिया के बाद निर्धारित कीन गै रही, रसायन के गुआकॉल (सीआई01,0 μT पोर्टलैंड, ओआर, यूएसए) अऊर 12 एमएम एच 2 ओ 2 के 100 μl। विधि का (एल-नागर एट अल., 2023; उस्मान एट अल., 2023) से थोड़ा संशोधित कीन गा रहा। परख 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीएच 6.0) मा ताजा तैयार 3 मिलीलीटर कैटेकोल घोल (थर्मो साइंटिफिक केमिकल्स, वाल्थम, एमए, यूएसए) (0.01 एम) के साथ प्रतिक्रिया के बाद कीन गा रहा। कैट गतिविधि का माप 240 एनएम (ए 240) पर एच 2 ओ 2 के अपघटन के निगरानी से कीन गा रहा, पीओएक्स गतिविधि का 436 एनएम (ए 436) पर अवशोषण मा वृद्धि के निगरानी से मापा गा रहा, अऊर पीपीओ गतिविधि का माप 495 एनएम (ए 495) पर हर 30 मिनट मा अवशोषण उतार-चढ़ाव के रिकॉर्डिंग से कीन गा रहा, जेहिमा यूवी-फोरोमीटर का उपयोग करत हुए हर 30 सेकंड मा कीन गा रहा। (शिमाडज़ू, जापान)।
तीन एंटीऑक्सीडेंट से संबंधित जीन के प्रतिलेख स्तर का पता लगावै के लिए वास्तविक समय आरटी-पीसीआर का उपयोग कीन गा रहा, जेहिमा पेरोक्सिसोमल कैटालेज (पीवीसीएटी 1; जेनबैंक एक्सेस नंबर केएफ033307.1), सुपरऑक्साइड डिस्मुटेज (पीवीएसओडी; जेनबैंक एक्सेस नंबर एक्सएम_0686395), अऊर ग्लूथियोन रिड्यूटेस (जीनबैंक; एक्सेस नंबर KY195009.1), बीन के पत्तन मा (ऊपर से दूसर अऊर तीसरा पूरा तरह से विकसित पत्ता) अंतिम उपचार के 72 घंटा बाद। संक्षेप मा, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार सिम्पली पी टोटल आरएनए एक्सट्रैक्शन किट (कैट. नंबर बीएससी52एस1; बायोफ्लक्स, बायोरी टेक्नोलॉजी, चीन) का उपयोग कइके आरएनए का अलग कीन गा रहा। फिर, निर्माता के निर्देशन के अनुसार टॉप स्क्रिप्ट TM सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कइके सीडीएनए संश्लेषित कीन गा रहा। उपरोक्त तीन जीन के प्राइमर अनुक्रम पूरक तालिका S3 मा सूचीबद्ध हैं। पीवीएक्टिन-3 (जेनबैंक एक्सेस नंबर: एक्सएम_068616709.1) का उपयोग हाउसकीपिंग जीन के रूप मा कीन गा रहा अऊर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति 2-ΔΔCT विधि (लिवाक अऊर श्मिटजेन, 2001) का उपयोग कइके गणना कीन गा रहा। जैविक तनाव (आम फलियां अऊर एंथ्रेक्नोज कवक कोलेटोट्रिचम लिंडेमुथियनम के बीच असंगत बातचीत) अऊर अजैविक तनाव (सूखा, लवणता, कम तापमान) के तहत एक्टिन स्थिरता का प्रदर्शन कीन गा रहा (बोर्जेस एट अल., 2012)।
हम शुरू मा प्रोटीन-प्रोटीन ब्लास्ट टूल (बीएलएएसटीपी 2.15.0+) (अल्टशुल एट अल।, 1997, 2005) का उपयोग कइके एस. स्क्लेरोटिओरम मा ऑक्सालोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (ओएएच) प्रोटीन के जीनोम-व्यापी इन सिलिको विश्लेषण किहिन। संक्षेप मा, हमने एस्परगिलस फिजिन्सिस सीबीएस 313.89 (एएफओएएच; टैक्साइड: 1191702; जेनबैंक एक्सेसन नंबर एक्सपी_040799428.1; 342 अमीनो एसिड) अऊर पेनिसिलियम लागेना (पीएलओएएच; टैक्साइड: 94218; जेनबैंक एक्सेसन नंबर; जेनबैंक एक्सेसन नंबर) से ओएएच का उपयोग किहिन। XP_056833920.1; 316 अमीनो एसिड) एस. स्क्लेरोटिओरम (टैक्साइड: 5180) मा समरूप प्रोटीन का मैप करै के लिए क्वेरी सीक्वेंस के रूप मा। नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इन्फॉर्मेशन (एनसीबीआई) वेबसाइट, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ पर जेनबैंक मा सबसे हाल ही मा उपलब्ध एस. स्क्लेरोटिओरम जीनोम डेटा के खिलाफ ब्लास्टपी करा गा रहा।
यहिके अलावा, एस. स्क्लेरोटिओरम (एसएसओएएच) से अनुमानित ओएएच जीन अऊर ए. फिजिनसिस सीबीएस 313.89 से एएफओएएच के विकासवादी विश्लेषण अऊर फ़ाइलोजेनेटिक ट्री अऊर पी. लागेना से पीएलओएएच का MEGA11 (तमुरा एट अल., 2021) अऊर जेटीटी एट अल. आधारित मॉडल मा अधिकतम संभावना विधि का उपयोग कइके अनुमान लगावा गा रहा। अल., 1992)। फ़ाइलोजेनेटिक ट्री का एस. स्क्लेरोटिओरम से सब अनुमानित ओएएच जीन (एसएसओएएच) के प्रोटीन अनुक्रमन के बहु संरेखण विश्लेषण अऊर बाधा-आधारित संरेखण उपकरण (कोबाल्ट; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools//cobalt_) अऊर (कोबैल्ट_कोबाल्ट) का उपयोग कइके क्वेरी अनुक्रम के साथ जोड़ा गा रहा। अगरवाला, 2007)। यहिके अलावा, एस. स्क्लेरोटियोरम से एसएसओएएच के सबसे अच्छा मिलान अमीनो एसिड अनुक्रमन का क्लस्टलडब्ल्यू (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) का उपयोग कइके क्वेरी अनुक्रमन (एएफओएएच अऊर पीएलओएएच) (लार्किन एट अल।, 2007) के साथ संरेखित कीन गा रहा, अऊर संरक्षित क्षेत्रन का संरेखित कीन गा रहा। उपकरण (संस्करण 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)।
इसके अलावा, एस. स्क्लेरोटियोरम एसएसओएएच के अनुमानित कार्यात्मक प्रतिनिधि डोमेन अऊर संरक्षित साइटन का इंटरप्रो टूल (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (ब्लम एट अल., 2021) का उपयोग कइके अलग-अलग परिवारन मा इंटरैक्टिव रूप से वर्गीकृत कीन गा रहा। अंत मा, अनुमानित एस. स्क्लेरोटिओरम एसएसओएएच के त्रि-आयामी (3डी) संरचना मॉडलिंग प्रोटीन होमोलॉजी/एनालॉजी रिकग्निशन इंजन (फायर2 सर्वर संस्करण 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.gic.c.ac.uk/~phyre2/html/page. 2015) अऊर स्विस-मॉडल सर्वर (https://swissmodel.expasy.org/) (बियासिनी एट अल., 2014) का उपयोग कइके मान्य कीन गा। अनुमानित त्रि-आयामी संरचनाओं (पीडीबी प्रारूप) का यूसीएसएफ-चिमेरा पैकेज (संस्करण 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (पेटरसन एट अल., 2004) का उपयोग कइके इंटरैक्टिव रूप से देखल गै रहा।
स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के मायसेलिया मा ऑक्सालोएसीटेट एसिटाइलहाइड्रोलेज (एसएसओएएच; जेनबैंक एक्सेस नंबर: एक्सएम_001590428.1) के प्रतिलेखन स्तर का निर्धारित करै के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय प्रतिदीप्ति पीसीआर का उपयोग कीन गा रहा। संक्षेप मा, एस. स्क्लेरोटिओरम का पीडीबी युक्त फ्लास्क मा टीका लगावा गा रहा अऊर एक हिलत इनक्यूबेटर (मॉडल: आई 2400, न्यू ब्रंसविक साइंटिफिक कंपनी, एडिसन, एनजे, यूएसए) मा 25 ± 2 °C पर 150 आरपीएम पर 24 घंटा अऊर लगातार अंधेरे (24 घंटा) मा माइसेलियम के विकास का उत्तेजित करै के लिए रखा गा रहा। वहिके बाद, कोशिका का अंतिम IC50 सांद्रता (लगभग 40 अऊर 3.2 मिलीग्राम/एल, क्रमशः) मा एल-ऑर्निथिन अऊर कवकनाशी रिजोलेक्स-टी के साथ इलाज कीन गा अऊर फिर उहै परिस्थितियन मा 24 घंटा अउर संवर्धित कीन गा। ऊष्मायन के बाद, संस्कृतियन का 5 मिनट के लिए 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा अऊर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए सुपरनेटेंट (फंगल मायसेलियम) एकत्र कीन गा रहा। इसी तरह, संक्रमित पौधन से 0, 24, 48, 72, 96 अऊर 120 घंटा बाद संक्रमित पौधन से फंगल मायसेलियम एकत्र कीन गा रहा, जे संक्रमित ऊतकों के सतह पर सफेद मोल्ड अऊर कपास मायसेलियम बनाये रहे। फंगल मायसेलियम से आरएनए निकाला गा रहा अऊर फिर ऊपर वर्णित के अनुसार सीडीएनए संश्लेषित कीन गा रहा। एसएसओएएच के लिए प्राइमर अनुक्रम पूरक तालिका एस 3 मा सूचीबद्ध हैं। SsActin (GenBank एक्सेस नंबर: XM_001589919.1) का उपयोग हाउसकीपिंग जीन के रूप मा कीन गा रहा, अऊर सापेक्ष जीन अभिव्यक्ति 2-ΔΔCT विधि (लिवाक अऊर श्मिटजेन, 2001) का उपयोग कइके गणना कीन गा रहा।
जू अऊर झांग (2000) के विधि के अनुसार थोड़े संशोधन के साथ आलू डेक्सट्रोज शोरबा (पीडीबी) अऊर फंगल रोगजनक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम युक्त पौधा के नमूना मा ऑक्सालिक अम्ल का निर्धारण कीन गा रहा। संक्षेप मा, एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट का पीडीबी युक्त फ्लास्क मा टीका लगावा गा रहा अऊर फिर एक हिलत इनक्यूबेटर (मॉडल I2400, न्यू ब्रंसविक साइंटिफिक कंपनी, एडिसन, एनजे, यूएसए) मा 150 आरपीएम पर 25 ± 2 °C पर 3-5 दिन तक लगातार अंधेरे मा (24 घंटा) मायसेलियल विकास का उत्तेजित करै के लिए संवर्धित कीन गा रहा। ऊष्मायन के बाद, फंगल कल्चर का पहिले व्हाटमैन # 1 फिल्टर पेपर के माध्यम से फ़िल्टर कीन गा रहा अऊर फिर अवशिष्ट मायसेलियम का हटावै के लिए 5 मिनट के लिए 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। ऑक्सालेट के आगे के मात्रात्मक निर्धारण के लिए सुपरनेटेंट का एकत्र अऊर 4°C पर संग्रहीत कीन गा रहा। पौधा के नमूना तैयार करै के लिए, लगभग 0.1 ग्राम पौधा ऊतक टुकड़न का आसुत जल (हर बार 2 मिलीलीटर) से तीन बार निकाला गा रहा। फिर नमूना 5 मिनट के लिए 2500 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहें, सुपरनेटेंट का व्हाटमैन नंबर 1 फिल्टर पेपर के माध्यम से सूखा फ़िल्टर कीन गा रहा अऊर आगे के विश्लेषण के लिए एकत्रित कीन गा रहा।
ऑक्सालिक एसिड के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, प्रतिक्रिया मिश्रण का निम्नलिखित क्रम मा एक ग्लास स्टॉपर ट्यूब मा तैयार कीन गा रहा: 0.2 मिलीलीटर नमूना (या पीडीबी कल्चर फिल्ट्रेट या ऑक्सालिक एसिड मानक घोल), 0.11 मिलीलीटर ब्रोमोफेनोल ब्लू (बीपीबी, 1 एमएम; फिशर केमिकल, पिट्सबर्ग, यूएसए, एमएल 1918 एमएल। सल्फ्यूरिक एसिड (H2SO4; अल-गोमहोरिया फार्मास्यूटिकल्स एंड मेडिकल सप्लाईज, काहिरा, मिस्र) अऊर 100 एमएम पोटेशियम डाइक्रोमेट (K2Cr2O7; TCI केमिकल्स, पोर्टलैंड, ओआर, यूएसए) के 0.176 मिलीलीटर, अऊर फिर घोल का पतला 48 एमएल पानी से पतला कीन गा अऊर जोरदार रूप से मिलावा गा। तुरंत 60 °C पानी के स्नान मा रखा जात है। मिनट के बाद, 0.5 मिलीलीटर सोडियम हाइड्रॉक्साइड घोल (NaOH; 0.75 M) मिला के प्रतिक्रिया का रोक दीन गा रहा। प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण (A600) का यूवी-160 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (शिमाडज़ू कॉर्पोरेशन, जापान) का उपयोग कइके 600 एनएम पर मापा गा रहा। पीडीबी अऊर आसुत जल का उपयोग क्रमशः संस्कृति निस्पंदन अऊर पौधा नमूना के मात्रा निर्धारण के लिए नियंत्रण के रूप मा कीन गा रहा। कल्चर फिल्ट्रेट्स मा ऑक्सालिक एसिड सांद्रता, जेका पीडीबी माध्यम (μg.mL−1) के प्रति मिलीलीटर ऑक्सालिक एसिड के माइक्रोग्राम के रूप मा व्यक्त कीन जात है, अऊर पत्ती के अर्क मा, जेका ताजा वजन के प्रति ग्राम ऑक्सालिक एसिड के माइक्रोग्राम के रूप मा व्यक्त कीन जात है (μg.g.g−1 FW), एक ऑक्सालिक एसिड गुफा वक्र (The Hermors) का उपयोग कइके निर्धारित कीन गा रहा। वैज्ञानिक रसायन, वाल्थम, एमए, यूएसए)।
पूरे अध्ययन के दौरान, सब प्रयोगन का एक पूरी तरह से यादृच्छिक डिजाइन (सीआरडी) मा डिज़ाइन कीन गा रहा, जेहिमा प्रति उपचार छह जैविक प्रतिकृति अऊर प्रति जैविक प्रतिकृति पांच बर्तन (प्रति बर्तन दुई पौधा) रहा जब तक कि अन्यथा न बतावा गा रहा। जैविक प्रतिकृति का डुप्लिकेट (दुई तकनीकी प्रतिकृति) मा विश्लेषण कीन गा रहा। तकनीकी प्रतिकृति का उपयोग एकै प्रयोग के प्रतिलिपि प्रस्तुत करै के जांच करै के लिए कीन गा रहा लेकिन नकली प्रतिकृति से बचे के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण मा उपयोग नाहीं कीन गा रहा। डेटा का सांख्यिकीय रूप से भिन्नता के विश्लेषण (एनोवा) का उपयोग कइके विश्लेषण कीन गा रहा, जेकरे बाद टकी-क्रैमर ईमानदारी से महत्वपूर्ण अंतर (एचएसडी) परीक्षण (पी ≤ 0.05) कीन गा रहा। इन विट्रो प्रयोगन के लिए, IC50 अऊर IC99 मानन के गणना प्रोबिट मॉडल का उपयोग कइके कीन गै रही अऊर 95% विश्वास अंतराल के गणना कीन गै रही।
मिस्र के एल गबिया गवर्नरेट मा अलग-अलग सोयाबीन के खेतन से कुल चार आइसोलेट एकत्रित कीन गा रहें। पीडीए माध्यम पर, सब आइसोलेट मलाईदार सफेद मायसेलियम पैदा किहिन जवन जल्दी से कपास सफेद (चित्र 1 ए) अऊर फिर स्क्लेरोटियम चरण मा बेज या भूरा होइ गवा। स्क्लेरोटिया आमतौर पर घने, काले, गोलाकार या अनियमित आकार के होत हैं, 5.2 से 7.7 मिमी लंबा अऊर 3.4 से 5.3 मिमी व्यास के होत हैं (चित्र 1 बी)। यद्यपि चार आइसोलेट ने 25 ± 2 °C (चित्र 1 ए) पर 10-12 दिन के ऊष्मायन के बाद संवर्धन माध्यम के किनारे पर स्क्लेरोटिया का एक सीमांत पैटर्न विकसित किहिन, प्रति प्लेट स्क्लेरोटिया के संख्या ओनके बीच काफी अलग रही (पी < 0.001), आइसोलेट 3 मा स्क्लेरोटिया के सबसे अधिक संख्या (253 ± 3.001) रही। प्रति प्लेट स्क्लेरोटिया; चित्र 1 सी)। इसी तरह, आइसोलेट #3 अन्य आइसोलेट (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; चित्र 1D) के तुलना मा पीडीबी मा अधिक ऑक्सालिक एसिड पैदा किहिस। आइसोलेट #3 मा फाइटोपैथोजेनिक कवक स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम के विशिष्ट रूपात्मक अऊर सूक्ष्म विशेषता देखाई दिहिस। उदाहरण के लिए, पीडीए पर, आइसोलेट # 3 के कॉलोनी तेजी से बढ़त रहीं, मलाईदार सफेद (चित्र 1 ए), रिवर्स बेज या हल्का सामन पीला-भूरा रहीं, अऊर 9 सेमी व्यास के प्लेट के सतह का पूरा तरह से ढँकय के लिए 25 ± 2°C पर 6-7 दिन के जरूरत पड़ी। उपरोक्त रूपात्मक अऊर सूक्ष्म विशेषता के आधार पर, आइसोलेट # 3 का स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम के रूप मा पहचाना गा रहा।
चित्र 1. आम फलियन के फसलन से एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट के विशेषता अऊर रोगजनकता। (ए) पीडीए माध्यम पर चार एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट्स के मायसेलियम वृद्धि, (बी) चार एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट्स के स्क्लेरोटिया, (सी) स्क्लेरोटिया के संख्या (प्रति प्लेट), (डी) पीडीबी माध्यम पर ऑक्सालिक एसिड स्राव (μg.mL−1), अऊर (ई) चार एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट्स के व्यावसायिक पैर पर संवेदनशील रोग गंभीरता (%)। ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा गीजा 3 किस्म। मान पांच जैविक प्रतिकृति (n = 5) के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करत हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारन के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का इंगित करत हैं (पी <0.05)। (एफ-एच) आइसोलेट # 3 (डीपीआई) के साथ टीकाकरण के 10 दिन बाद क्रमशः जमीन के ऊपर के तने अऊर सिलिक पर विशिष्ट सफेद मोल्ड लक्षण दिखाई दिहिन। (I) एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट # 3 के आंतरिक प्रतिलेखित स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र का विकासवादी विश्लेषण अधिकतम संभावना विधि का उपयोग कइके कीन गा रहा अऊर राष्ट्रीय जैव प्रौद्योगिकी सूचना केंद्र (एनसीबीआई) डेटाबेस (https://www.ncbi.nlm.gov/) से प्राप्त 20 संदर्भ आइसोलेट/उपभेदन के साथ तुलना कीन गा रहा। क्लस्टरिंग लाइन के ऊपर के संख्या क्षेत्र कवरेज (%) का इंगित करत है, अऊर क्लस्टरिंग लाइन के नीचे के संख्या शाखा के लंबाई का इंगित करत है।
इसके अलावा, रोगजनकता के पुष्टि करै के लिए, चार प्राप्त एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट का उपयोग ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा संवेदनशील वाणिज्यिक बीन किस्म गीजा 3 का टीका लगावै के लिए कीन गा रहा, जवन कोच के पोस्टुलेट (चित्र 1 ई) के अनुरूप है। यद्यपि प्राप्त सब फंगल आइसोलेट रोगजनक रहे अऊर हरी बीन (सीवी गीजा 3) का संक्रमित कइ सकत रहे, जेसे जमीन के ऊपर के सब हिस्सान (चित्र 1एफ) पर विशिष्ट सफेद फफूंदी के लक्षण पैदा होत रहे, खासकर टीकाकरण के बाद 10 दिन बाद तना (चित्र 1जी) अऊर फली (चित्र 1एच) पर (चित्र 1एच), आइसोलेट आइसोलेट सबसे आक्रामक रहा। दुई स्वतंत्र प्रयोग। आइसोलेट 3 मा बीन पौधन पर सबसे अधिक रोग गंभीरता (%) रही (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0, अऊर 76.7 ± 3.1 क्रमशः 7, 14 अऊर 21 दिन संक्रमण के बाद; चित्र 1एफ)।
आंतरिक प्रतिलेखित स्पेसर (आईटीएस) अनुक्रमण (चित्र 1I) के आधार पर सबसे आक्रामक एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट # 3 के पहचान आगे पुष्टि कीन गै रही। आइसोलेट #3 अऊर 20 संदर्भ आइसोलेट/उपभेदन के बीच वंशावली विश्लेषण ओनके बीच उच्च समानता (>99%) देखाइस। ई ध्यान देय लायक है कि एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट # 3 (533 बीपी) मा सूखे मटर के बीज (जेनबैंक एक्सेस नंबर एमके896659.1; 540 बीपी) अऊर चीनी एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट नंबर वाईके896659.1; 540 बीपी) से अलग कीन गा अमेरिकी एस. स्क्लेरोटिओरम आइसोलेट एलपीएम36 से बहुत समानता है। OR206374.1; 548 bp), जवन वायलेट (मैथियोला इंकाना) स्टेम सड़ांध का कारण बनत है, जवन सब डेंड्रोग्राम के ऊपर अलग-अलग समूहीकृत हैं (चित्र 1I)। नया अनुक्रम एनसीबीआई डेटाबेस मा जमा कीन गा है अऊर ओका "स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटिओरम - आइसोलेट वाईएन-25" (जेनबैंक एक्सेस नंबर पीवी202792) नामित कीन गा है। ई देखल जा सकत है कि आइसोलेट 3 सबसे आक्रामक आइसोलेट है; यहिसे, ई आइसोलेट का बाद के सब प्रयोगन मा अध्ययन के लिए चुना गा रहा।
एस. स्क्लेरोटियोरम आइसोलेट 3 के खिलाफ अलग-अलग सांद्रता (12.5, 25, 50, 75, 100 अऊर 125 मिलीग्राम/लीटर) मा डायमिन एल-ऑर्निथिन (सिग्मा-एल्ड्रिच, डार्मस्टैड, जर्मनी) के जीवाणुरोधी गतिविधि के इन विट्रो मा जांच कीन गै रही। ई उल्लेखनीय है कि एल-ऑर्निथिन ने एक जीवाणुरोधी प्रभाव डाला अऊर धीरे-धीरे खुराक-निर्भर तरीका से एस. स्क्लेरोटिओरम हाइफे के रेडियल विकास का रोका (चित्र 2 ए, बी)। परीक्षण कीन गा सबसे अधिक सांद्रता (125 मिलीग्राम/लीटर) मा, एल-ऑर्निथिन ने सबसे अधिक मायसेलियल विकास निषेध दर (99.62 ± 0.27%; चित्र 2 बी) का प्रदर्शन किहिन, जवन वाणिज्यिक कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (निषेध दर 99.45 ± 0.39%; चित्र 2 सी) के बराबर रहा, परीक्षण कीन गा उच्चतम सांद्रता (10 एमजी/एल) पर परीक्षण कीन गा रहा। समान प्रभावकारिता का इंगित करत है।
चित्र 2. स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के खिलाफ एल-ऑर्निथिन के इन विट्रो जीवाणुरोधी गतिविधि। (ए) वाणिज्यिक कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (10 मिलीग्राम/एल) के साथ एस. स्क्लेरोटियोरम के खिलाफ एल-ऑर्निथिन के विभिन्न सांद्रता के जीवाणुरोधी गतिविधि के तुलना। (बी, सी) क्रमशः एल-ऑर्निथिन (12.5, 25, 50, 75, 100 अऊर 125 मिलीग्राम/एल) या रिजोलेक्स-टी (2, 4, 6, 8 अऊर 10 मिलीग्राम/एल) के अलग-अलग सांद्रता के साथ उपचार के बाद एस. स्क्लेरोटिओरम मायसेलियल विकास के निषेध दर (%)। मान पांच जैविक प्रतिकृति (n = 5) के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करत हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारन के बीच सांख्यिकीय अंतर का दर्शावत हैं (पी <0.05)। (डी, ई) क्रमशः एल-ऑर्निथिन अऊर वाणिज्यिक कवकनाशी रिजोलेक्स-टी का प्रोबिट मॉडल प्रतिगमन विश्लेषण। प्रोबिट मॉडल प्रतिगमन रेखा का एक ठोस नीली रेखा के रूप मा देखावा गा है, अऊर विश्वास अंतराल (95%) का एक धराशायी लाल रेखा के रूप मा देखावा गा है।
यहिके अलावा, प्रोबिट प्रतिगमन विश्लेषण कीन गा रहा अऊर संबंधित भूखंड तालिका 1 अऊर चित्र 2D,E मा देखावा गा है। संक्षेप मा, एल-ऑर्निथिन के स्वीकार्य ढलान मान (y = 2.92x − 4.67) अऊर संबंधित महत्वपूर्ण आंकड़ा (कॉक्स एंड स्नेल आर 2 = 0.3709, नागेलकेर्के आर 2 = 0.4998 अऊर पी <0.0001; चित्र 2 डी) ने व्यावसायिक एसकेक्लेयर के खिलाफ एक बढ़ी हुई एंटीफंगल गतिविधि का संकेत दिया। कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (वाई = 1.96x − 0.99, कॉक्स एंड स्नेल आर 2 = 0.1242, नागेलकेर्के आर 2 = 0.1708 अऊर पी <0.0001) (तालिका 1)।
तालिका 1. एस. स्क्लेरोटिओरम के खिलाफ एल-ऑर्निथिन अऊर वाणिज्यिक कवकनाशी "रिजोलेक्स-टी" के आधा-अधिकतम निरोधात्मक सांद्रता (आईसी50) अऊर आईसी99 (मिलीग्राम/लीटर) के मान।
कुल मिला के, एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/एल) ने अनुपचारित एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित पौधन (नियंत्रण; चित्र 3 ए) के तुलना मा उपचारित आम बीन पौधन पर सफेद मोल्ड के विकास अऊर गंभीरता का काफी कम कर दिहिस। संक्षेप मा, यद्यपि अनुपचारित संक्रमित नियंत्रण पौधन के रोग गंभीरता धीरे-धीरे बढ़ गै (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61, अऊर 92.33 ± 3.06%), एल-ऑर्निथिन ने पूरे प्रयोग मा रोग गंभीरता (%) का काफी कम कर दिहिस (8.97 ± 1.05, 8.00 ± .000, 100 ± .00, . 26.36 ± 3.07) क्रमशः 7, 14 अऊर 21 दिन बाद उपचार (डीपीटी) मा (चित्र 3 ए)। इसी तरह, जब एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित बीन पौधन का 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन से इलाज कीन गा रहा, तौ रोग प्रगति वक्र (एयूडीपीसी) के तहत क्षेत्र अनुपचारित नियंत्रण मा 1274.33 ± 33.13 से घट के 281.03 ± 7.95 होइ गवा, जवन 50 नियंत्रण से थोड़ा कम रहा। मिलीग्राम/एल रिजोलेक्स-टी कवकनाशी (183.61 ± 7.71; चित्र 3 बी)। दूसर प्रयोग मा भी यही प्रवृत्ति देखी गै रही।
चित्र 3. ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम के कारण आम बीन के सफेद सड़ांध के विकास पर एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग का प्रभाव। (ए) 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन के साथ उपचार के बाद आम बीन के सफेद मोल्ड के रोग प्रगति वक्र। (बी) एल-ऑर्निथिन के साथ उपचार के बाद आम बीन के सफेद मोल्ड के रोग प्रगति वक्र (एयूडीपीसी) के तहत क्षेत्र। मान पांच जैविक प्रतिकृति (n = 5) के औसत ± एसडी का प्रतिनिधित्व करत हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारन के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का दर्शावत हैं (पी <0.05)।
250 मिलीग्राम/एल एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग से 42 दिन के बाद धीरे-धीरे पौधा के ऊंचाई (चित्र 4 ए), प्रति पौधा शाखाओं के संख्या (चित्र 4 बी), अऊर प्रति पौधा पत्तियन के संख्या (चित्र 4 सी) बढ़ जात है। जबकि वाणिज्यिक कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (50 मिलीग्राम/लीटर) का अध्ययन कीन गा सब पोषण पैरामीटरन पर सबसे बड़ा प्रभाव रहा, 250 मिलीग्राम/लीटर एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग का अनुपचारित नियंत्रणन के तुलना मा दूसर सबसे बड़ा प्रभाव रहा (चित्र 4 ए-सी)। दूसर ओर, एल-ऑर्निथिन उपचार का प्रकाश संश्लेषक वर्णक क्लोरोफिल ए (चित्र 4डी) अऊर क्लोरोफिल बी (चित्र 4ई) के सामग्री पर कौनो महत्वपूर्ण प्रभाव नाहीं पड़ा, लेकिन नकारात्मक नियंत्रण (0.56 ± 0.03 मिलीग्राम / ग्राम एफआर डब्ल्यूटी) सकारात्मक अऊर सकारात्मक अऊर फीट / एफआर डब्ल्यूटी के तुलना मा कुल कैरोटीनॉयड सामग्री (0.56 ± 0.03 मिलीग्राम / ग्राम एफआर डब्ल्यूटी) मा थोड़ा वृद्धि भै। नियंत्रण (0.46 ± 0.02 मिलीग्राम/जी एफआर डब्ल्यूटी; चित्र 4एफ)। कुल मिला के, ई परिणाम बतावत हैं कि एल-ऑर्निथिन उपचारित फलियन के लिए फाइटोटॉक्सिक नाहीं है अऊर ओनके विकास का भी उत्तेजित कइ सकत है।
चित्र 4. ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा स्क्लेरोटिनिया स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित बीन के पत्तन के विकास विशेषता अऊर प्रकाश संश्लेषण वर्णक पर बहिर्जात एल-ऑर्निथिन अनुप्रयोग का प्रभाव। (ए) पौधा के ऊंचाई (सेमी), (बी) प्रति पौधा शाखाओं के संख्या, (सी) प्रति पौधा पत्तन के संख्या, (डी) क्लोरोफिल ए सामग्री (मिलीग्राम जी-1 एफआर डब्ल्यूटी), (ई) क्लोरोफिल बी सामग्री (मिलीग्राम जी-1 एफआर डब्ल्यूटी), (एफ) कुल कैरोटीनॉइड सामग्री (मिलीग्राम जी-1 एफआर डब्ल्यूटी)। मान पांच जैविक प्रतिकृति (n = 5) का औसत ± एसडी हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारन के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का इंगित करत हैं (पी <0.05)।
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजाति (ROS; हाइड्रोजन पेरोक्साइड [H2O2] के रूप मा व्यक्त) अऊर मुक्त कण (सुपरऑक्साइड आयन [O2•−] के रूप मा व्यक्त) के इन सिटु हिस्टोकेमिकल स्थानीयकरण से पता चला कि एल-ऑर्निथिन (250 मिलीग्राम/एल) के बहिर्जात अनुप्रयोग से H2O (250 ± 255 ± 36) के संचय मा काफी कमी आई। nmol.g−1 FW; चित्र 5A) अऊर O2•− (32.69 ± 8.56 nmol.g−1 FW; चित्र 5B) दुनौ अनुपचारित संक्रमित पौधन (173.31 ± 12.06 अऊर 149.35 ± 7.94 nmol.g−1 FW, क्रमशः उपचारित पौधा) के संचय के तुलना मा वाणिज्यिक कवकनाशी रिजोलेक्स-टी (170.12 ± 9.50 अऊर 157.00 ± 7.81 एनएमओएल.जी-1 एफआर डब्ल्यूटी, क्रमशः) का मिलीग्राम/लीटर 72 घंटा मा। hpt (चित्र 5A, B) के तहत H2O2 अऊर O2•− के उच्च स्तर जमा होइ गवा। इसी तरह, टीसीए-आधारित मैलोन्डियाल्डिहाइड (एमडीए) परख से पता चला कि एस. स्क्लेरोटिओरम-संक्रमित बीन पौधे अपने पत्तन मा एमडीए (113.48 ± 10.02 एनएमओएल.जी एफआर डब्ल्यूटी) के उच्च स्तर जमा करत हैं (चित्र 5 सी)। हालांकि, एल-ऑर्निथिन के बहिर्जात अनुप्रयोग से लिपिड पेरोक्सिडेशन मा काफी कमी आई, जइसन कि उपचारित पौधन मा एमडीए सामग्री मा कमी (33.08 ± 4.00 एनएमओएल.जी एफआर डब्ल्यूटी) से पता चलत है।
चित्र 5. ग्रीनहाउस परिस्थितियन मा संक्रमण के 72 घंटा बाद एस. स्क्लेरोटियोरम से संक्रमित बीन के पत्तन मा ऑक्सीडेटिव तनाव अऊर गैर-एंजाइमी एंटीऑक्सीडेंट रक्षा तंत्र के प्रमुख मार्करन पर बहिर्जात एल-ऑर्निथिन अनुप्रयोग का प्रभाव। (A) हाइड्रोजन पेरोक्साइड (H2O2; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (B) सुपरऑक्साइड आयन (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (C) मैलोनडाइल्डिहाइड (MDA; nmol g−1 FW) 72 hpt पर, (D) कुल घुलनशील फिनोल (GAE G−1 FW) 72 hpt पर एचपीटी, (ई) कुल घुलनशील फ्लेवोनोइड्स (मिलीग्राम आरई जी-1 एफडब्ल्यू) 72 एचपीटी पर, (एफ) कुल मुक्त अमीनो एसिड (मिलीग्राम जी-1 एफडब्ल्यू) 72 एचपीटी पर, अऊर (जी) प्रोलिन सामग्री (मिलीग्राम जी-1 एफडब्ल्यू) 72 एचपीटी पर। मान 5 जैविक प्रतिकृति (n = 5) के औसत ± मानक विचलन (माध्य ± एसडी) का प्रतिनिधित्व करत हैं। अलग-अलग अक्षर उपचारन के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर का इंगित करत हैं (पी <0.05)।