वर्तमान *वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सीलेंस क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर स्ट्रेस रिस्पांस इन एजिंग-रिलेटेड डिजीज (सीईसीएडी)।
माइटोकॉन्ड्रियल रोगन के न्यूरोडिजनरेशन का अपरिवर्तनीय माना जात है काहे से कि न्यूरॉन्स के चयापचय प्लास्टिसिटी सीमित है, लेकिन शरीर मा न्यूरोनल चयापचय के कोशिका स्वायत्तता पर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के प्रभाव का खराब समझा जात है। हिंया, हम बाधित माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन डायनामिक्स के कारण प्रगतिशील OXPHOS कमी के साथ पुर्किन्जे न्यूरॉन्स के कोशिका-विशिष्ट प्रोटीओम का पेश करत हैं। हमने पावा कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से प्रोटिओमिक्स के क्षेत्र मा एक गहरा बदलाव आवा, जेहिसे अंततः कोशिका मृत्यु से पहिले सटीक चयापचय कार्यक्रमन के क्रमिक सक्रियता होइ। अप्रत्याशित रूप से, हम टीसीए चक्र मध्यवर्ती के पूरक से संबंधित पाइरूवेट कार्बोक्सिलेज (पीसीएक्स) अऊर अन्य पेरोक्सिडेस के स्पष्ट प्रेरण का निर्धारित किहिन। पीसीएक्स के निषेध से ऑक्सीडेटिव तनाव अऊर न्यूरोडिजनरेशन बढ़ जात है, जेसे पता चलत है कि एथेरोस्क्लेरोसिस का ओएक्सपीएचओएस के कमी वाले न्यूरॉन्स मा सुरक्षात्मक प्रभाव पड़त है। टर्मिनल अपरिवर्तित न्यूरॉन्स मा माइटोकॉन्ड्रियल संलयन के बहाली इन चयापचय विशेषताओं का पूरी तरह से उलट देत है, जेहिसे कोशिका मृत्यु रोका जात है। हमार निष्कर्ष पहिले से अज्ञात मार्गन के पहचान करत हैं जवन माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का लचीलापन प्रदान करत हैं अऊर देखावत हैं कि रोग के देर से चरणन मा भी न्यूरोडिजनरेशन का उलटा कीन जा सकत है।
मानव माइटोकॉन्ड्रियल रोगन से जुड़े व्यापक न्यूरोलॉजिकल लक्षणन से तंत्रिका ऊर्जा चयापचय का बनाए रखै मा माइटोकॉन्ड्रिया के केंद्रीय भूमिका पर जोर दीन जात है। इनमा से अधिकांश रोग जीन उत्परिवर्तन के कारण होत हैं जवन माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति (1, 2) या माइटोकॉन्ड्रियल गतिकी से संबंधित जीन विनाश का नियंत्रित करत हैं, जवन अप्रत्यक्ष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए (एमटीडीएनए) (3, 4) के स्थिरता का प्रभावित करत हैं। पशु मॉडल मा काम से पता चला है कि आसपास के ऊतकों मा माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के जवाब मा, रूढ़िवादी चयापचय मार्ग (5-7) सक्रिय कीन जा सकत हैं, जेहिसे इन जटिल रोगन के रोगजनन मा महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि मिलत है। एकदम विपरीत, मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रियल एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) उत्पादन के सामान्य विफलता के कारण विशिष्ट कोशिका प्रकारन के चयापचय परिवर्तनन के बारे मा हमार समझ मौलिक है (8), चिकित्सीय लक्ष्यन के पहचान करै के जरूरत पर जोर देत है जेका रोग का रोकै या रोकै के लिए उपयोग कीन जा सकत है। न्यूरोडिजनरेशन (9) का रोके। जानकारी के कमी ई तथ्य है कि तंत्रिका कोशिकाओं का व्यापक रूप से आसपास के ऊतकों के कोशिका प्रकारन के तुलना मा बहुत सीमित चयापचय लचीलापन माना जात है (10)। ई देखत हुए कि ई कोशिका सिनैप्टिक संचरण का बढ़ावा देय अऊर चोट अऊर बीमारी के स्थितियन का जवाब देय के लिए न्यूरॉन्स के चयापचय के आपूर्ति के समन्वय मा एक केंद्रीय भूमिका निभात हैं, मस्तिष्क ऊतक के चुनौतीपूर्ण स्थितियन के लिए कोशिका चयापचय का अनुकूलित करै के क्षमता लगभग ग्लियाल कोशिका तक सीमित है (11-14)। यहिके अलावा, मस्तिष्क ऊतक के अंतर्निहित कोशिकीय विषमता विशिष्ट तंत्रिका उपसमूहन मा होए वाले चयापचय परिवर्तनन के अध्ययन मा काफी हद तक बाधा डालत है। नतीजतन, न्यूरॉन्स मा माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के सटीक सेलुलर अऊर चयापचय परिणामन के बारे मा बहुत कम जानकारी है।
माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के चयापचय परिणामन का समझै के खातिर, हम माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली संलयन (एमएफएन 2) के विनाश के कारण न्यूरोडिजनरेशन के विभिन्न चरणन मा पुर्किनजे न्यूरॉन्स (पीएन) का अलग किहिन। यद्यपि मनुष्यन मा Mfn2 उत्परिवर्तन वंशानुगत मोटर संवेदी न्यूरोपैथी के एक रूप से जुड़े होत हैं जेका चारकोट-मैरी-टूथ टाइप 2A (15) के रूप मा जाना जात है, चूहों मा Mfn2 का सशर्त विनाश ऑक्सीकरण फास्फारिलीकरण (OXPHOS) शिथिलता विधि का एक अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त प्रेरण है। विभिन्न न्यूरोनल उपप्रकार (16-19) अऊर परिणामी न्यूरोडिजेनेरेटिव फेनोटाइप प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल लक्षणन के साथ होत हैं, जइसे कि आंदोलन विकार (18, 19) या सेरिबेलर एटैक्सिया (16)। लेबल-मुक्त मात्रात्मक (एलएफक्यू) प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग अऊर वायरोलॉजिकल विधियन के संयोजन का उपयोग कइके, हम देखावत हैं कि प्रगतिशील न्यूरोडिजनरेशन पाइरूवेट कार्बोक्सिलेज (पीसीएक्स) अऊर विवो मा पीएन के धमनीकाठिन्य मा शामिल अन्य कारकन का दृढ़ता से प्रेरित करत है एंजाइमन के अभिव्यक्ति। यहि खोज के प्रासंगिकता का सत्यापित करै के ताईं, हम विशेष रूप से Mfn2-कमी वाले PNs मा PCx के अभिव्यक्ति का डाउन-रेगुलेट किहिन, अऊर पावा कि ई ऑपरेशन ऑक्सीडेटिव तनाव का बढ़ावत है अऊर न्यूरोडिजनरेशन का तेज करत है, जेहिसे ई साबित होत है कि एज़ोस्पर्मिया कोशिका मृत्यु चयापचय अनुकूलन क्षमता प्रदान करत है। एमएफएन 2 के गंभीर अभिव्यक्ति गंभीर ओएक्सपीएचओएस कमी, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के भारी खपत अऊर जाहिर तौर पर टूटे माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क के साथ टर्मिनल अपघटन पीएन का पूरी तरह से बचा सकत है, जवन आगे जोर देत है कि न्यूरोडिजनरेशन का ई रूप कोशिका मृत्यु से पहिले बीमारी के उन्नत चरण मा भी ठीक होइ सकत है।
Mfn2 नॉकआउट पीएन मा माइटोकॉन्ड्रिया का कल्पना करै के खातिर, हम एक माउस तनाव का उपयोग किहिन जवन Cre-निर्भर माइटोकॉन्ड्रिया का पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्ति का लक्ष्य बनावै के अनुमति देत है अऊर इन विवो मा माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान के जांच किहिन। हमने पावा कि पीएन मा एमएफएन 2 जीन के विनाश माइटोकॉन्ड्रियल नेटवर्क (चित्र एस 1 ए) के धीरे-धीरे विभाजन का जन्म देई, अऊर सबसे पहिले बदलाव 3 सप्ताह के उम्र मा पावा गा रहा। यहिके विपरीत, पीएन सेल परत के पर्याप्त अपघटन, जइसन कि कैलबिंडिन इम्यूनोस्टेनिंग के नुकसान से पता चलत है, 12 सप्ताह के उम्र तक शुरू नाहीं भवा (चित्र 1, ए अऊर बी)। माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान मा सबसे पहिले बदलाव अऊर तंत्रिका मृत्यु के दृश्यमान शुरुआत के बीच समय बेमेल हमका कोशिका मृत्यु से पहिले माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से उत्पन्न चयापचय परिवर्तनन के जांच करै के लिए प्रेरित किहिस। हमने YFP (YFP+)-एक्सप्रेसिंग PN (चित्र 1C) का अलग करै के लिए एक प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (FACS)-आधारित रणनीति विकसित की, अऊर नियंत्रण चूहों (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) मा, जेका आगे CTRL (चित्र S1B) के रूप मा संदर्भित कीन गा है। वाईएफपी संकेत के सापेक्ष तीव्रता के आधार पर गेटिंग रणनीति के अनुकूलन हमका गैर-पीएन (वाईएफपीएनईजी) (चित्र एस 1 बी) या पुटेटिव फ्लोरोसेंट एक्सन / डेंड्रिटिक टुकड़न (वाईएफपीलो; चित्र एस 1 डी, बाएं) से पीएन के वाईएफपी + शरीर (वाईएफपी हाई) का शुद्ध करै के अनुमति देत है, जेकर पुष्टि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप (चित्र एस 1 डी, दाएं) से कीन जात है। वर्गीकृत आबादी के पहचान का सत्यापित करै के खातिर, हम LFQ प्रोटिओमिक्स अऊर फिर प्रमुख घटक विश्लेषण किहिन, अऊर पावा कि YFPhigh अऊर YFPneg कोशिका के बीच एक स्पष्ट अलगाव है (चित्र S1C)। YFPhigh कोशिका ज्ञात PNs मार्करन (यानी Calb1, Pcp2, Grid2 अऊर Itpr3) (21, 22) का शुद्ध संवर्धन देखाइस, लेकिन आमतौर पर न्यूरॉन्स या अन्य कोशिका प्रकारन मा व्यक्त प्रोटीन का कौनो संवर्धन नाहीं देखाइस (चित्र 1D))। स्वतंत्र प्रयोगन मा एकत्रित वर्गीकृत YFPhigh कोशिका मा नमूना के बीच एक तुलना एक सहसंबंध गुणांक> 0.9 देखाइस, जवन जैविक प्रतिकृतियन के बीच अच्छा प्रतिलिपि प्रस्तुत करै के क्षमता का दर्शाता है (चित्र S1E)। संक्षेप मा, ई डेटा व्यवहारिक पीएन के तीव्र अऊर विशिष्ट अलगाव के लिए हमार योजना का सत्यापित किहिन। काहे से कि उपयोग कीन गा L7-cre ड्राइवर सिस्टम प्रसव के बाद पहिले हफ्ता मा मोज़ेक पुनर्संयोजन का प्रेरित करत है (23), हम CTRL अऊर सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन्स एकत्रित करै से चूहों का काटब शुरू किहिन। पुनर्संयोजन पूरा होए के बाद, 4 सप्ताह के उम्र मा एकरा Mfn2cKO कहा जात है। अंतिम बिंदु के रूप मा, हम 8 सप्ताह के उम्र का चयन किहिन जब पीएन परत स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रियल टुकड़न के बावजूद अभी भी बरकरार रही (चित्र 1 बी अऊर चित्र एस 1 ए)। कुल मिला के, हम कुल 3013 प्रोटीन के मात्रा निर्धारित किहिन, जेहिमा से लगभग 22% माइटोकॉन्ड्रिया (चित्र 1 ई) (चित्र 1 ई) (24) के रूप मा माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटिओम के आधार पर माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन पर आधारित रहे। सप्ताह 8 मा कीन गा विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला कि सब प्रोटीन मा से केवल 10.5% मा महत्वपूर्ण बदलाव रहे (चित्र 1एफ अऊर चित्र एस1एफ), जेहिमा से 195 प्रोटीन डाउन-रेगुलेट अऊर 120 प्रोटीन अप-रेगुलेट रहे (चित्र 1एफ)। ई ध्यान देय लायक है कि ई डेटा सेट के "अभिनव मार्ग विश्लेषण" से पता चलत है कि विभेदक रूप से व्यक्त जीन मुख्य रूप से विशिष्ट चयापचय मार्गन के एक प्रतिबंधित सेट से संबंधित हैं (चित्र 1 जी)। दिलचस्प बात ई है कि, यद्यपि OXPHOS अऊर कैल्शियम सिग्नलिंग से संबंधित मार्गन के डाउन-रेगुलेशन फ्यूजन-कमी वाले पीएन मा माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के प्रेरण के पुष्टि करत है, अन्य श्रेणियन मा मुख्य रूप से अमीनो एसिड चयापचय शामिल है, जवन माइटोकॉन्ड्रियल पीएन मा होए वाले चयापचय के अनुरूप है। पुन: वायरिंग सुसंगत है। विकार।
(ए) सीटीआरएल अऊर एमएफएन2सीकेओ चूहों के सेरिबैलर खंडन के प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ पीएन (कैलबिंडिन, ग्रे) के प्रगतिशील नुकसान देखावत हैं; नाभिक का डीएपीआई से काउंटरस्टेन कीन गा रहा। (बी) (ए) का माप (भिन्नता का एकतरफा विश्लेषण, *** पी <0.001; तीन चूहों से एन = 4 से 6 वृत्त)। (सी) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह। (डी) पुर्किन्जे (ऊपर) अऊर अन्य कोशिका प्रकारन (बीच) के लिए विशिष्ट मार्करन का हीट मैप वितरण। (ई) वर्गीकृत पीएन मा पहचाने गए माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के संख्या देखावै वाला वेन आरेख। (एफ) 8 सप्ताह मा Mfn2cKO न्यूरॉन्स मा विभेदक रूप से व्यक्त प्रोटीन का ज्वालामुखी भूखंड (1.3 का महत्व कट-ऑफ मान)। (जी) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषण 8 सप्ताह के रूप मा वर्गीकृत Mfn2cKO PN मा पांच सबसे महत्वपूर्ण अप-रेगुलेशन (लाल) अऊर डाउन-रेगुलेशन (नीला) मार्ग देखावत है। हर पता लगावा गा प्रोटीन के औसत अभिव्यक्ति स्तर देखावा गा है। ग्रेस्केल हीट मैप: समायोजित पी मान। ns, महत्वपूर्ण नाहीं है।
प्रोटिओमिक्स डेटा से पता चला कि कॉम्प्लेक्स I, III अऊर IV के प्रोटीन अभिव्यक्ति धीरे-धीरे कम होइ गै। कॉम्प्लेक्स I, III अऊर IV मा सब मा आवश्यक mtDNA-एन्कोडेड सबयूनिट शामिल रहे, जबकि कॉम्प्लेक्स II, जवन केवल परमाणु-कोडित रहा, मूल रूप से अप्रभावित रहा (चित्र 2A अऊर चित्र S2A)। . प्रोटिओमिक्स परिणामन के अनुरूप, सेरिबेलर ऊतक खंडन के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पता चला कि पीएन मा कॉम्प्लेक्स IV के एमटीसीओ 1 (माइटोकॉन्ड्रियल साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट 1) सबयूनिट स्तर धीरे-धीरे कम होइ गवा (चित्र 2 बी)। एमटीडीएनए-एन्कोडेड सबयूनिट एमटीएटीपी 8 काफी कम होइ गवा रहा (चित्र एस 2 ए), जबकि परमाणु-एन्कोडेड एटीपी सिंथेसेस सबयूनिट का स्थिर-राज्य स्तर अपरिवर्तित रहा, जवन एमटीडीएनए अभिव्यक्ति स्थिर होए पर ज्ञात स्थिर एटीपी सिंथेसेस सबअसेंबली एफ 1 कॉम्प्लेक्स के अनुरूप है। गठन सुसंगत है। बाधित करा (7)। वास्तविक समय पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा क्रमबद्ध Mfn2cKO PNs मा mtDNA स्तर के मूल्यांकन से mtDNA कॉपी संख्या मा धीरे-धीरे कमी के पुष्टि भै। नियंत्रण समूह के तुलना मा, 8 सप्ताह के उम्र मा, mtDNA स्तर का केवल लगभग 20% बरकरार रखा गा रहा (चित्र 2C)। इन परिणामन के अनुरूप, डीएनए का पता लगावै के लिए Mfn2cKO PNs के कन्फोकल माइक्रोस्कोपी धुंधलापन माइटोकॉन्ड्रियल न्यूक्लियोटाइड्स के समय-निर्भर खपत का देखावत है (चित्र 2D)। हमने पावा कि माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन गिरावट अऊर तनाव प्रतिक्रिया मा शामिल केवल कुछ उम्मीदवारन का अप-रेगुलेट कीन गा रहा, जेहिमा Lonp1, Afg3l2 अऊर Clpx, अऊर OXPHOS जटिल असेंबली कारक शामिल रहे। एपोप्टोसिस मा शामिल प्रोटीन के स्तर मा कौनो महत्वपूर्ण बदलाव नाहीं पावा गा रहा (चित्र S2B)। इसी तरह, हमने पावा कि कैल्शियम परिवहन मा शामिल माइटोकॉन्ड्रिया अऊर एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम चैनलन मा केवल मामूली बदलाव होत हैं (चित्र S2C)। यहिके अलावा, ऑटोफेजी से संबंधित प्रोटीन के मूल्यांकन मा कौनो महत्वपूर्ण बदलाव नाहीं मिला, जवन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अऊर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्र एस 3) द्वारा विवो मा देखे गए ऑटोफेगोसोम के दृश्यमान प्रेरण के अनुरूप है। हालांकि, पीएन मा प्रगतिशील ओएक्सपीएचओएस शिथिलता के साथ स्पष्ट अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन होत हैं। माइटोकॉन्ड्रियल क्लस्टर 5 अऊर 8 सप्ताह के Mfn2cKO PNs के कोशिका निकायन अऊर डेंड्रिटिक पेड़न मा देखे जा सकत हैं, अऊर आंतरिक झिल्ली संरचना मा गहरा बदलाव आवा है (चित्र S4, A अऊर B)। इन अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनन अऊर एमटीडीएनए मा महत्वपूर्ण कमी के अनुरूप, टेट्रामेथिलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (टीएमआरएम) के साथ तीव्र सेरेब्रल सेरेबैलर स्लाइस के विश्लेषण से पता चला कि एमएफएन 2 सीकेओ पीएनएस मा माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता मा काफी कमी आई रही (चित्र एस 4 सी)।
(A) OXPHOS कॉम्प्लेक्स के अभिव्यक्ति स्तर का समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। केवल 8 सप्ताह मा P<0.05 वाले प्रोटीन पर विचार करा (दो-तरफा एनोवा)। बिंदीदार रेखा: सीटीआरएल के तुलना मा कौनो समायोजन नाहीं है। (बी) बाईं ओर: एंटी-एमटीसीओ 1 एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) के साथ लेबल किए गए एक सेरिबैलर खंड का एक उदाहरण। पुर्किन्जे सेल बॉडीज द्वारा कब्जा कीन गा क्षेत्र पीला रंग से ढका अहै। दाईं ओर: एमटीसीओ 1 स्तरन का माप (भिन्नता का एक तरफा विश्लेषण; तीन चूहों से विश्लेषण कीन गा n = 7 से 20 कोशिका)। (सी) क्रमबद्ध पीएन मा एमटीडीएनए प्रतिलिपि संख्या का क्यूपीसीआर विश्लेषण (भिन्नता का एकतरफा विश्लेषण; एन = 3 से 7 चूहे)। (डी) बाईं ओर: एक एंटी-डीएनए एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) के साथ लेबल किए गए एक सेरिबैलर स्लाइस का एक उदाहरण। पुर्किन्जे सेल बॉडीज द्वारा कब्जा कीन गा क्षेत्र पीला रंग से ढका अहै। दाईं ओर: एमटीडीएनए घावों का माप (भिन्नता का एकतरफा विश्लेषण; तीन चूहों से एन = 5 से 9 कोशिका)। (ई) एक तीव्र सेरिबैलर खंड का एक उदाहरण जवन एक पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग मा माइटोवाईएफपी + पुर्किंज कोशिका (तीर) देखावत है। (एफ) IV वक्र का माप। (जी) सीटीआरएल अऊर एमएफएन2सीकेओ पुर्किंज कोशिका मा विध्रुवीकरण करंट इंजेक्शन के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग। शीर्ष निशान: पहिला नाड़ी जवन एपी का ट्रिगर करत है। नीचे का निशान: अधिकतम एपी आवृत्ति। (एच) पोस्टसिनैप्टिक सहज इनपुट (एसपीएसपी) का मात्रा निर्धारण। प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग ट्रेस अऊर ओकर ज़ूम अनुपात (I) मा देखावा गा है। भिन्नता के एकतरफा विश्लेषण तीन चूहों से n = 5 से 20 कोशिकाओं का विश्लेषण किहिन। डेटा का औसत ± एसईएम के रूप मा व्यक्त कीन जात है; *पी<0.05; **पी<0.01; ***पी<0.001। (जे) छिद्रित पैच क्लैंप मोड का उपयोग कइके दर्ज कीन गा सहज एपी के प्रतिनिधि निशान। शीर्ष निशान: अधिकतम एपी आवृत्ति। नीचे का निशान: एक एकल एपी का ज़ूम। (के) (जे) के अनुसार औसत अऊर अधिकतम एपी आवृत्ति का मापौ। मान-व्हिटनी परीक्षण; n = 5 कोशिका चार चूहों से विश्लेषण कीन गै रहीं। डेटा का औसत ± एसईएम के रूप मा व्यक्त कीन जात है; महत्वपूर्ण नाहीं।
सप्ताह पुरान Mfn2cKO PN मा स्पष्ट OXPHOS क्षति का पता चला, जवन बतावत है कि न्यूरॉन्स के शारीरिक कार्य गंभीर रूप से असामान्य है। यहिसे, हम तीव्र सेरिबेलर स्लाइस (चित्र 2 ई) मा पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग कइके 4 से 5 सप्ताह अऊर 7 से 8 सप्ताह मा OXPHOS-कमी वाले न्यूरॉन्स के निष्क्रिय विद्युत विशेषताओं का विश्लेषण किहिन। अप्रत्याशित रूप से, Mfn2cKO न्यूरॉन्स के औसत आराम झिल्ली क्षमता अऊर इनपुट प्रतिरोध नियंत्रण के समान रहे, हालांकि कोशिका के बीच सूक्ष्म अंतर रहे (तालिका 1)। इसी तरह, 4 से 5 सप्ताह के उम्र मा, वर्तमान-वोल्टेज संबंध (IV वक्र) मा कौनो महत्वपूर्ण बदलाव नाहीं पावा गा रहा (चित्र 2F)। हालांकि, 7 से 8 सप्ताह पुरान कौनो भी Mfn2cKO न्यूरॉन्स IV आहार (हाइपरपोलराइजेशन स्टेप) से नहीं बचा, जेसे पता चलत है कि ई देर से चरण मा हाइपरपोलराइजेशन क्षमता के प्रति स्पष्ट संवेदनशीलता है। यहिके विपरीत, Mfn2cKO न्यूरॉन्स मा, विध्रुवीकरण धारा जवन दोहराए जाने वाले क्रिया विभव (एपी) निर्वहन का कारण बनत हैं, अच्छी तरह से सहन कीन जात हैं, जेसे पता चलत है कि ओनके समग्र निर्वहन पैटर्न 8 सप्ताह पुरान नियंत्रण न्यूरॉन्स (तालिका 1 अऊर चित्र 2 जी) से महत्वपूर्ण रूप से अलग नाहीं हैं। इसी तरह, सहज पोस्टसिनैप्टिक धाराओं (एसपीएससी) के आवृत्ति अऊर आयाम नियंत्रण समूह के तुलना मा रहे, अऊर घटनाओं के आवृत्ति 4 सप्ताह से 5 सप्ताह से 7 सप्ताह से 8 सप्ताह तक एक समान वृद्धि के साथ बढ़ गै (चित्र 2, एच अऊर आई)। पीएन (25) मा सिनैप्टिक परिपक्वता के अवधि। छिद्रित पीएनएस पैच के बाद समान परिणाम प्राप्त कीन गा रहें। ई विन्यास सेलुलर एटीपी दोषन के संभावित मुआवजा का रोकत है, जइसे कि पूरे कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग मा होइ सकत है। विशेष रूप से, Mfn2cKO न्यूरॉन्स के आराम झिल्ली क्षमता अऊर सहज फायरिंग आवृत्ति प्रभावित नाहीं भै (चित्र 2, जे अऊर के)। संक्षेप मा, ई परिणाम बतावत हैं कि स्पष्ट OXPHOS शिथिलता वाले पीएन उच्च-आवृत्ति निर्वहन पैटर्न से अच्छी तरह से निपट सकत हैं, ई बतावत है कि एक मुआवजा तंत्र है जवन ओनका निकट-सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं का बनाए रखे के अनुमति देत है।
डेटा का औसत ± SEM (भिन्नता का एक तरफा विश्लेषण, होल्म-सिडक का बहु तुलना परीक्षण; * P<0.05) के रूप मा व्यक्त कीन जात है। इकाई संख्या कोष्ठक से इंगित कीन जात है।
हम ई जांच करै के लिए निकलेन कि का प्रोटिओमिक्स डेटासेट (चित्र 1 जी) मा कौनो श्रेणी मा अइसन मार्ग शामिल हैं जवन गंभीर ओएक्सपीएचओएस कमी का मुकाबला कर सकत हैं, जेहिसे ई बतावा जात है कि प्रभावित पीएन निकट-सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (चित्र 2, ई से के) का बनाए रख सकत है। . प्रोटिओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि शाखा श्रृंखला अमीनो एसिड (बीसीएए) के अपचय में शामिल एंजाइम काफी अप-रेगुलेटेड रहे (चित्र 3 ए अऊर चित्र एस 5 ए), अऊर अंतिम उत्पाद एसिटाइल-सीओए (सीओए) या सुक्सिनिल सीओए धमनीकाठिन्य अम्ल (टीसीए) चक्र में ट्राइकार्बोक्सिलेट्स का पूरक हो सकत है। हमने पावा कि बीसीएए ट्रांसएमिनेज 1 (बीसीएटी1) अऊर बीसीएटी2 दुइनौ के सामग्री बढ़ गै। उइ α-केटोग्लूटारेट (26) से ग्लूटामेट उत्पन्न कइके बीसीएए अपचय के पहिला चरण का उत्प्रेरित किहिन। शाखा श्रृंखला कीटो एसिड डिहाइड्रोजेनेज (बीसीकेडी) कॉम्प्लेक्स बनावै वाले सब सबयूनिट अपरेगुलेट होत हैं (कम्प्लेक्स परिणामी बीसीएए कार्बन कंकाल के बाद के अऊर अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्सीलेशन का उत्प्रेरित करत है) (चित्र 3 ए अऊर चित्र एस 5 ए)। हालांकि, क्रमबद्ध पीएन मा बीसीएए मा खुद कौनो स्पष्ट बदलाव नाहीं पावा गा रहा, जवन कि इन आवश्यक अमीनो एसिड के बढ़ल सेलुलर अवशोषण या टीसीए चक्र (चित्र एस 5 बी) के पूरक के लिए अन्य स्रोतन (ग्लूकोज या लैक्टिक एसिड) के उपयोग के कारण हो सकत है। ओएक्सपीएचओएस के कमी वाले पीएन ने 8 सप्ताह के उम्र मा ग्लूटामाइन अपघटन अऊर ट्रांसएमिनेशन गतिविधियन मा वृद्धि भी देखाई दिहिस, जेका माइटोकॉन्ड्रियल एंजाइम ग्लूटामिनेज (जीएलएस) अऊर ग्लूटामाइन पाइरूवेट ट्रांसएमिनेज 2 (जीपीटी 2) (चित्र 3, ए अऊर सी) के अप-रेगुलेशन से परिलक्षित कीन जा सकत है। ई ध्यान देय लायक है कि जीएलएस का अप-रेगुलेशन स्प्लिस्ड आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेज सी (जीएलएस-जीएसी) तक सीमित है (एमएफएन2सीकेओ/सीटीआरएल का बदलाव लगभग 4.5-गुना है, पी = 0.05), अऊर कैंसर ऊतकों मा एकर विशिष्ट अप-रेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रियल बायोएनर्जी का समर्थन कर सकत है। (27)
(ए) हीट मैप 8 सप्ताह मा निर्दिष्ट मार्ग के लिए प्रोटीन स्तर मा गुना परिवर्तन देखावत है। (बी) एंटी-पीसीएक्स एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) के साथ लेबल किए गए एक सेरिबैलर स्लाइस का उदाहरण। पीला तीर पुर्किन्जे सेल बॉडी के ओर इशारा करत है। (सी) एथेरोस्क्लेरोसिस (बहु टी-टेस्ट, *एफडीआर <5%; एन = 3-5 चूहे) के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार के रूप में पहचाना गया समय पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। (डी) ऊपर: एक योजनाबद्ध आरेख जवन [1-13C] पाइरूवेट ट्रेसर (यानी, पीडीएच या ट्रांस-धमनी मार्ग के माध्यम से) मा निहित लेबल कार्बन मा प्रवेश करै के अलग-अलग तरीका देखावत है। नीचे: वायलिन चार्ट [1-13C] पाइरूवेट (युग्मित टी-टेस्ट; ** पी <0.01) के साथ तीव्र सेरिबैलर स्लाइस के लेबल लगावै के बाद एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड अऊर मैलिक एसिड मा परिवर्तित एकल-लेबल कार्बन (एम 1) का प्रतिशत देखावत है। (ई) संकेतित पथ का व्यापक समय इतिहास विश्लेषण। केवल 8 सप्ताह मा P<0.05 वाले प्रोटीन पर विचार करा। धराशायी रेखा: कौनो समायोजन मान नाहीं (भिन्नता का दु-तरफा विश्लेषण; * पी <0.05; *** पी <0.001)। डेटा का औसत ± SEM के रूप मा व्यक्त कीन जात है।
हमरे विश्लेषण मा, बीसीएए अपचय प्रमुख अप-नियमन मार्गन में से एक बन गवा है। ई तथ्य दृढ़ता से बतावत है कि टीसीए चक्र मा प्रवेश करै वाली वेंटिलेशन आयतन ओएक्सपीएचओएस के कमी वाले पीएन मा बदल सकत है। ई तंत्रिका चयापचय रीवायरिंग के एक प्रमुख रूप का प्रतिनिधित्व कर सकत है, जेकर गंभीर OXPHOS शिथिलता के रखरखाव के दौरान तंत्रिका शरीर विज्ञान अऊर अस्तित्व पर सीधा प्रभाव पड़ सकत है। यहि परिकल्पना के अनुरूप, हमने पावा कि मुख्य एंटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंजाइम पीसीएक्स अप-रेगुलेटेड है (एमएफएन2सीकेओ/सीटीआरएल लगभग 1.5 बार बदलत है; चित्र 3 ए), जवन पाइरूवेट के ऑक्सालोएसीटेट (28) मा बदलै का उत्प्रेरित करत है, जेकरे बारे मा माना जात है कि मस्तिष्क ऊतकों मा अभिव्यक्ति प्रतिबंधित है। (29, 30) प्रोटिओमिक्स परिणामन के अनुरूप, कन्फोकल माइक्रोस्कोपी से पता चला कि पीसीएक्स अभिव्यक्ति ओएक्सपीएचओएस-कमी वाले पीएन मा विशेष रूप से अऊर महत्वपूर्ण रूप से बढ़ गै रही, जबकि पीसीएक्स प्रतिक्रियाशीलता मुख्य रूप से नियंत्रण के आसन्न बर्गमैन ग्लियाल कोशिका तक सीमित रही (चित्र 3 बी)। पीसीएक्स के देखे गए अपरेग्यूलेशन का कार्यात्मक रूप से परीक्षण करै के लिए, हम [1-13C] पाइरूवेट ट्रेसर के साथ तीव्र सेरिबैलर स्लाइस का इलाज किहिन। जब पाइरूवेट का पाइरूवेट डिहाइड्रोजेनेज (पीडीएच) द्वारा ऑक्सीकरण कीन गा रहा, तौ ओकर समस्थानिक लेबल गायब होइ गवा रहा, लेकिन जब पाइरूवेट का संवहनी प्रतिक्रियाओं (चित्र 3डी) द्वारा चयापचय कीन जात है तो टीसीए चक्र मध्यवर्ती मा शामिल कीन जात है। अपने प्रोटिओमिक्स डेटा के समर्थन मा, हमने Mfn2cKO स्लाइस के एस्पार्टिक एसिड मा ई ट्रेसर से बड़ी संख्या मा मार्करन का अवलोकन किहिन, जबकि साइट्रिक एसिड अऊर मैलिक एसिड मा भी एक मध्यम प्रवृत्ति रही, हालांकि महत्वपूर्ण नाहीं रहा (चित्र 3डी)।
माइटोपार्क चूहों के डोपामाइन न्यूरॉन्स मा माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के साथ डोपामाइन न्यूरॉन्स के कारण विशेष रूप से माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए जीन (टीएफएएम) (चित्र एस 6 बी) का नष्ट करत है, पीसीएक्स अभिव्यक्ति भी काफी अप-रेगुलेट कीन गा रहा (31), जेसे पता चलत है कि एसीटोन एसिड धमनीकाठिन्य रोग के घटना न्यूरॉन डिसफंक्शन के दौरान विनियमित होत है शरीर मा ऑक्सफोस। ई ध्यान देवे लायक है कि ई पावा गा है कि अद्वितीय एंजाइम (32-34) जवन न्यूरॉन्स मा व्यक्त कीन जा सकत हैं जवन धमनीकाठिन्य से जुड़े होइ सकत हैं, ओएक्सपीएचओएस मा कमी वाले पीएन मा काफी अप-रेगुलेट होत हैं, जइसे कि प्रोपियोनिल-सीओए कार्बोक्जिलेज (पीसीसी-ए), मैलोनिल-सीओए प्रोपियोनिल-सीओए माइटोकोनिल-ए अऊर सुक्सीकोन्ड्रियल माइटोकोनिल-ए में बदल देत है। एंजाइम 3 (एमई 3), जेकर मुख्य भूमिका मैलेट से पाइरूवेट का पुनर्प्राप्त करब है (चित्र 3, ए अऊर सी) (33, 35)। यहिके अलावा, हमने Pdk3 एंजाइम मा एक महत्वपूर्ण वृद्धि पाई, जवन PDH (36) का फास्फोरिलेट करत है अऊर यहि तरह निष्क्रिय करत है, जबकि Pdp1 एंजाइम मा कौनो बदलाव नाहीं पावा गा रहा जवन PDH या PDH एंजाइम कॉम्प्लेक्स का खुद सक्रिय करत है (चित्र 3A)। लगातार, Mern2cKO PNs मा, Ser293 (PDH के एंजाइम गतिविधि का रोकै के लिए जाना जात है) मा PDH कॉम्प्लेक्स के पाइरूवेट डिहाइड्रोजेनेज E1 घटक के α1 सबयूनिट α (PDHE1α) सबयूनिट के फास्फारिलीकरण बढ़ावा गा रहा (चित्र S6C) (चित्र S6C)। पाइरूवेट के पास संवहनी पहुंच नाहीं है।
अंत मा, हमने पावा कि सक्रियण प्रक्रिया के दौरान, रिपोर्ट के अनुसार, सेरीन अऊर ग्लाइसिन बायोसिंथेसिस के सुपर पाथवे, संबंधित माइटोकॉन्ड्रियल फोलेट (1 सी) चक्र अऊर प्रोलिन बायोसिंथेसिस (चित्र 1 जी अऊर चित्र एस 5 सी) सब काफी अप-रेगुलेट होत हैं। आसपास के ऊतक माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन (5-7) के साथ सक्रिय होत हैं। इन प्रोटिओमिक्स डेटा का समर्थन करै वाले कन्फोकल विश्लेषण से पता चला कि ओएक्सपीएचओएस के साथ पीएन मा, 8 सप्ताह के चूहों के सेरिबैलर स्लाइस सेरीन हाइड्रोक्सीमिथाइलट्रांसफेरेज 2 (एसएचएमटी 2) के अधीन रहे, जवन माइटोकॉन्ड्रियल फोलेट चक्र के एक प्रमुख एंजाइम है। महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र एस 5 डी)। सीयू-ग्लूकोज-ऊष्मायन तीव्र सेरिबैलर स्लाइस मा, चयापचय अनुरेखण प्रयोगन से सेरीन अऊर प्रोलिन जैव संश्लेषण के अप-रेगुलेशन के अउर पुष्टि कीन गै, जेसे पता चलत है कि सेरीन अऊर प्रोलिन मा कार्बन आइसोफॉर्म के प्रवाह बढ़ गा है (चित्र एस 5 ई)। चूंकि जीएलएस अऊर जीपीटी 2 द्वारा बढ़ावा दीन जाय वाली प्रतिक्रिया ग्लूटामाइन से ग्लूटामेट के संश्लेषण अऊर ग्लूटामेट अऊर α-केटोग्लुटारेट के बीच ट्रांसमिनेशन के लिए जिम्मेदार हैं, ओनके अपरेग्यूलेशन से पता चलत है कि ओएक्सपीएचओएस-कमी वाले न्यूरॉन्स मा ग्लूटामेट के मांग बढ़ जात है, ई प्रोलाइन के बढ़े जैव संश्लेषण का बनाए रखे के उद्देश्य से हो सकत है (चित्र एस5)। इन बदलावन के विपरीत, पीएन-विशिष्ट एमएफएन2सीकेओ चूहों से सेरिबेलर एस्ट्रोसाइट्स के एक प्रोटिओमिक विश्लेषण से पता चला कि ई मार्ग (सभी एंटीपेरोक्सिडेस सहित) अभिव्यक्ति मा महत्वपूर्ण रूप से नहीं बदले, यहिसे ई चयापचय पुनर्निर्देशन अपरिवर्तित पीएन (चित्र एस 6, डी से जी) के लिए चयनात्मक है।
संक्षेप मा, ई विश्लेषण पीएन मा विशिष्ट चयापचय मार्गन के अस्थायी सक्रियण के काफी अलग पैटर्न का पता लगाइन। यद्यपि असामान्य न्यूरोनल माइटोकॉन्ड्रियल कार्य से शुरुआती एथेरोस्क्लेरोसिस अऊर 1 सी रीमॉडलिंग (चित्र 3 ई अऊर चित्र एस 5 सी) होइ सकत है, अऊर इहाँ तक कि I अऊर IV परिसरन के अभिव्यक्ति मा अनुमानित बदलाव भी होइ सकत है, सेरीन डी नोवो संश्लेषण मा बदलाव केवल ई केवल देर से चरणन मा स्पष्ट होइ गवा। ऑक्सफोस डिसफंक्शन (चित्र 3 ई अऊर चित्र एस 5 सी)। ई निष्कर्ष एक क्रमिक प्रक्रिया का परिभाषित करत हैं जेहिमा तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल (1 सी चक्र) अऊर कोशिका द्रव्य (सेरीन जैव संश्लेषण) प्रतिक्रिया टीसीए चक्र मा एथेरोस्क्लेरोसिस मा वृद्धि के साथ तंत्रिका चयापचय का फिर से आकार देत हैं।
8-सप्ताह पुरान ओएक्सपीएचओएस-कमी वाले पीएन उच्च-आवृत्ति उत्तेजना गतिविधि का बनाए रख सकत हैं अऊर माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता के भरपाई करै के लिए महत्वपूर्ण चयापचय पुनर्संयोजन से गुजर सकत हैं। ई खोज एक दिलचस्प संभावना पैदा करत है कि यहि समय भी, ई कोशिका न्यूरोडिजनरेशन का देरी या रोकै के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप भी प्राप्त कइ सकत हैं। द्यार\देर। हम दुई स्वतंत्र हस्तक्षेप के माध्यम से ई संभावना का हल किहिन। पहली विधि मा, हम एक Cre-निर्भर एडेनो-संबंधित वायरस (AAV) वेक्टर डिजाइन किहिन ताकि MFN2 का विवो मा OXPHOS-कमी वाले PNs मा चुनिंदा रूप से व्यक्त कीन जा सके (चित्र S7A)। एमएफएन 2 एन्कोडिंग एएवी अऊर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन एमचेरी (एमएफएन 2-एएवी) का इन विट्रो मा प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृतियन मा सत्यापित कीन गा रहा, जेहिसे एमएफएन 2 का क्री-निर्भर तरीका से व्यक्त कीन गा रहा अऊर माइटोकॉन्ड्रियल आकृति विज्ञान का बचावा गा रहा, जेहिसे एमएफएन 2 सीकेओ न्यूरॉन्स मा न्यूरोम्यूटेशन का रोका गा रहा (चित्र एस7, बी अऊर ई अऊर डी)। अगला, हमने Mfn2cKO अऊर नियंत्रण चूहों के सेरिबैलर कॉर्टेक्स मा 8-सप्ताह पुरान Mfn2-AAV का स्टीरियोटैक्टिक रूप से वितरित करै के लिए इन विवो प्रयोग किहिन, अऊर 12-सप्ताह पुरान चूहों (चित्र 4 ए) का विश्लेषण किहिन। इलाज कीन गा Mfn2cKO चूहा मर गए (चित्र 1, ए अऊर बी) (16)। विवो मा वायरल ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप कुछ सेरिबैलर सर्कल मा पीएन के चयनात्मक अभिव्यक्ति भै (चित्र एस 7, जी अऊर एच)। केवल mCherry (Ctrl-AAV) का व्यक्त करै वाले नियंत्रण AAV के इंजेक्शन का Mfn2cKO जानवरन मा न्यूरोडिजनरेशन के डिग्री पर कौनो महत्वपूर्ण प्रभाव नाहीं पड़ा। यहिके विपरीत, Mfn2-AAV के साथ संचारित Mfn2cKOs के विश्लेषण से PN सेल परत (चित्र 4, बी अऊर सी) का एक महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव देखा गा। विशेष रूप से, न्यूरॉन घनत्व नियंत्रण जानवरन से लगभग अप्रभेद्य लागत है (चित्र 4, बी अऊर सी, अऊर चित्र एस 7, एच अऊर आई)। एमएफएन 1 के अभिव्यक्ति लेकिन एमएफएन 2 नाहीं तंत्रिका मृत्यु का बचावै मा समान रूप से प्रभावी है (चित्र 4 सी अऊर चित्र एस 7, सी अऊर एफ), जवन इंगित करत है कि एक्टोपिक एमएफएन 1 के अभिव्यक्ति एमएफएन 2 के कमी का प्रभावी ढंग से पूरक बना सकत है। एकल पीएन स्तर पर आगे के विश्लेषण से पता चला कि एमएफएन 2-एएवी ने काफी हद तक माइटोकॉन्ड्रिया के अल्ट्रास्ट्रक्चर का बचावा, एमटीडीएनए स्तर का सामान्य बनावा, अऊर एंटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर पीसीएक्स (चित्र 4, सी से ई) के उच्च अभिव्यक्ति का उलट दिहिस। आराम करत अवस्था मा बचावा गा Mfn2cKO चूहों के दृश्य निरीक्षण से पता चला कि ओनके मुद्रा अऊर मोटर लक्षण (आंदोलन S1 से S3) मा सुधार भा रहा। निष्कर्ष के तौर पर, ई प्रयोग बतावत हैं कि OXPHOS मा गंभीर कमी वाले PNs मा MFN2 का विलंबित पुन: परिचय mtDNA खपत का उलटै अऊर एथेरोस्क्लेरोसिस का प्रेरित करै के लिए पर्याप्त है, जेहिसे विवो मा अक्षतंतु अपघटन अऊर तंत्रिका मृत्यु का रोका जा सकत है।
(ए) एक योजना जवन एएवी एन्कोडिंग एमएफएन 2 इंजेक्ट करै के लिए प्रयोगात्मक कार्यक्रम देखावत है जब संकेतित चयापचय मार्ग सक्रिय होत है। (बी) 8 सप्ताह मा Mfn2cKO चूहों के साथ संचारित अऊर एंटी-कैलबिंडिन एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए 12 सप्ताह पुराने सेरिबैलर खंडन के प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ। दाईं ओर: अक्षतंतु फाइबरन का स्केलिंग। अक्षतंतु ज़ूम का पैमाना 450 अऊर 75 माइक्रोन है। (सी) बाईं ओर: एएवी ट्रांसडक्शन लूप (एएवी +) (भिन्नता का एक तरफा विश्लेषण; एन = 3 चूहे) में पुर्किन्जे सेल घनत्व का मात्रा निर्धारण। दाईं ओर: सप्ताह 12 मा ट्रांसड्यूस्ड पीएन मा एमटीडीएनए फोकस विश्लेषण (अयुग्मित टी-टेस्ट; तीन चूहों से एन = 6 कोशिका)। * पी <0.05; ** पी <0.01। (D) संकेतित वायरल वैक्टर के साथ संचारित Mfn2cKO सेरिबैलर खंडन के पीएन के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। गुलाबी मुखौटा डेंड्राइट्स द्वारा कब्जा कीन गा क्षेत्र का दर्शाता है, अऊर पीला बिंदीदार वर्ग दाईं ओर प्रदान कीन गा ज़ूम का दर्शाता है; n नाभिक का प्रतिनिधित्व करत है। स्केल बार, 1 माइक्रोन। (ई) 12 सप्ताह मा संचारित पीएन मा पीसीएक्स धुंधलापन का एक उदाहरण देखावत है। स्केल बार, 20 माइक्रोन। ओई, ओवरएक्सप्रेशन; एफसी, गुना बदलाव।
अंत मा, हम पीएन मा पेरोक्सिडेज-प्रेरित कोशिका अस्तित्व के महत्व के जांच किहिन जे ओएक्सपीएचओएस शिथिलता का अनुभव किहिन हैं। हमने एमचेरी एन्कोडिंग एएवी-एसएचआरएनए (छोटा हेयरपिन आरएनए) उत्पन्न किहिन जवन विशेष रूप से माउस पीसीएक्स एमआरएनए (एएवी-एसएचपीसीएक्स) का लक्ष्य बनावत अहै, अऊर वायरस या ओकर स्क्रैम्बल्ड कंट्रोल (एएवी-एससीआर) का एमएफएन2सीकेओ चूहों के सेरिबैलम मा इंजेक्ट किहिन। इंजेक्शन उम्र के चौथे सप्ताह (चित्र 5 ए) मा कीन गा रहा ताकि उ अवधि के दौरान प्रभावी पीसीएक्स नॉकडाउन प्राप्त कीन जा सके जब पीसीएक्स अभिव्यक्ति बढ़ी (चित्र 3 सी) अऊर पीएन सेल परत अभी भी बरकरार रही (चित्र 1 ए)। ई ध्यान देय लायक है कि पीसीएक्स (चित्र एस 8 ए) का गिरावै से पीएन मृत्यु मा एक महत्वपूर्ण त्वरण होत है, जवन संक्रमण के एकमात्र प्रतिबंधित अंगूठी है (चित्र 5, बी अऊर सी)। पीसीएक्स अप-रेगुलेशन से प्रेरित चयापचय प्रभावन के तंत्र का समझै के खातिर, हम पीसीएक्स नॉकडाउन के बाद पीएन के रेडॉक्स स्थिति का अध्ययन किहिन अऊर एएवी-मध्यस्थता ऑप्टिकल बायोसेंसर जीआरएक्स 1-आरओजीएफपी 2 का एक साथ व्यक्त कीन गा रहा (चित्र एस 8, बी से डी) ग्लूटाथियोन का मूल्यांकन करै के लिए रेडॉक्स पेप्टाइड क्षमता के सापेक्ष परिवर्तन (388)। फिर, हमने एफएलआईएम स्थितियन (चित्र एस 8, ई से जी) के सत्यापित करै के बाद कोशिका द्रव्य रेडॉक्स स्थिति मा संभावित बदलावन का पता लगावै के लिए 7-सप्ताह पुरान एमएफएन2सीकेओ या नियंत्रण लिटरमेट्स के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस मा दुई-फोटॉन प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (एफएलआईएम) किहिन। विश्लेषण से पता चला कि एकल Mfn2cKO PNs के ऑक्सीकरण अवस्था मा PCx अभिव्यक्ति के कमी है, जवन नियंत्रण न्यूरॉन्स या Mfn2cKO PNs से अलग है जवन केवल स्क्रैम्बल्ड shRNA (चित्र 5, D अऊर E) व्यक्त करत हैं। जब पीसीएक्स अभिव्यक्ति का डाउन-रेगुलेट कीन गा रहा, तौ अत्यधिक ऑक्सीकृत अवस्था देखावै वाले एमएफएन2सीकेओ पीएन का प्रतिशत तीन गुना से अधिक बढ़ गा (चित्र 5 ई), जेसे पता चलत है कि पीसीएक्स अप-रेगुलेशन अपरिवर्तित न्यूरॉन्स के रेडॉक्स क्षमता का बनाए रखत है।
(A) एक योजना जवन एएवी एन्कोडिंग shPCx इंजेक्ट करै के लिए प्रयोगात्मक अनुसूची देखावत है जब संकेतित चयापचय मार्ग सक्रिय होत है। (बी) 4 सप्ताह मा एंटी-कैल्सिन्यूरिन एंटीबॉडी के साथ ट्रांसड्यूस अऊर लेबल कीन गा Mfn2cKO चूहों मा 8-सप्ताह पुरान सेरिबैलर खंडन के प्रतिनिधि कन्फोकल फोटोग्राफ। स्केल बार, 450 माइक्रोन। (सी) एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप्स (भिन्नता का एक तरफा विश्लेषण; एन = 3 से 4 चूहे) मा पुर्किन्जे सेल घनत्व का मात्रा निर्धारण। डेटा का औसत ± एसईएम के रूप मा व्यक्त कीन जात है; ***पी<0.001। (D) प्रतिनिधि FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थितियन के तहत ग्लूटाथियोन रेडॉक्स सेंसर Grx1-roGFP2 व्यक्त करै वाले 7-सप्ताह पुराने PN के औसत जीवन काल देखावत है। एलयूटी (लुक-अप टेबल) अनुपात: अस्तित्व समय अंतराल (पिकोसेकंड मा)। स्केल बार, 25 माइक्रोन। (ई) हिस्टोग्राम (डी) से Grx1-roGFP2 जीवनकाल मानन के वितरण का देखावत है (प्रत्येक स्थिति के तहत दुई चूहों मा n=158 से 368 कोशिका)। हर हिस्टोग्राम के ऊपर पाई चार्ट: काफी लंबा (लाल, ऑक्सीकृत) या छोटा (नीला, कम) जीवन काल मान वाले कोशिकाओं के संख्या देखावत है, जवन CTRL-AAV-scr मा औसत जीवन काल मान के 1 SD से अधिक है। (एफ) प्रस्तावित मॉडल न्यूरोनल पीसीएक्स के अपरेग्यूलेशन के सुरक्षात्मक प्रभाव का देखावत है।
कुल मिला के, हम हिंया प्रदान करत डेटा से पता चलत है कि एमएफएन 2 के पुन: अभिव्यक्ति गंभीर ओएक्सपीएचओएस कमी, गंभीर एमटीडीएनए कमी अऊर अत्यधिक असामान्य इस्टा-जैसी आकृति विज्ञान के साथ उन्नत पीएन का पूरी तरह से बचा सकत है, जेहिसे उन्नत बीमारियन मा भी निरंतर प्रगति प्रदान कीन जा सकत है। न्यूरोडिजनरेशन कोशिका मृत्यु से पहिले के चरण के प्रतिवर्ती साक्ष्य प्रदान करत है। चयापचय लचीलापन के ई डिग्री का न्यूरॉन्स के एथेरोस्क्लेरोसिस (टीसीए चक्र के पुन: वायरिंग) का प्रेरित करै के क्षमता से अउर जोर दीन जात है, जवन ओएक्सपीएचओएस के कमी वाले पीएन मा पीसीएक्स अभिव्यक्ति का रोकत है अऊर कोशिका मृत्यु का बढ़ावत है, जेहिसे एक सुरक्षात्मक भूमिका निभाई जात है (चित्र 5एफ)।
यहि अध्ययन मा, हम सबूत प्रदान किहिन कि OXPHOS शिथिलता के लिए पीएन के प्रतिक्रिया चयापचय कार्यक्रमन द्वारा सक्रिय विभेदक सक्रियण मार्ग के माध्यम से धीरे-धीरे टीसीए चक्र एथेरोस्क्लेरोसिस मा अभिसरण करब है। हम कई पूरक विधियन के साथ प्रोटिओमिक विश्लेषण के पुष्टि किहिन अऊर पता चला कि जब गंभीर माइटोकॉन्ड्रियल शिथिलता से चुनौती दीन जात है, तौ न्यूरॉन्स मा चयापचय लोच का पहिले से अज्ञात रूप होत है। हमरे आश्चर्य के लिए, पूरा रीवायरिंग प्रक्रिया जरूरी नहीं है कि टर्मिनल चयापचय स्थिति का चिह्नित करत है जवन धीरे-धीरे अऊर अपरिवर्तनीय रूप से न्यूरोडिजनरेशन के साथ होत है, लेकिन हमार डेटा बतावत है कि ई कोशिका मृत्यु से पहिले के चरण मा भी एक रखरखाव न्यूरॉन का गठन कर सकत है कार्यात्मक मुआवजा तंत्र। ई खोज बतावत है कि न्यूरॉन्स मा शरीर मा चयापचय प्लास्टिसिटी के काफी डिग्री होत है। ई तथ्य साबित करत है कि एमएफएन 2 के बाद के पुन: परिचय प्रमुख चयापचय मार्करन के अभिव्यक्ति का उलट सकत है अऊर पीएन अपघटन का रोक सकत है। उल्टा, ई एथेरोस्क्लेरोसिस का रोकत है अऊर नसों का तेज करत है। ट्रांससेक्सुअल।
हमरे शोध मा सबसे आकर्षक निष्कर्षन में से एक ई है कि OXPHOS के कमी वाले पीएन टीसीए चक्र चयापचय का संशोधित कर सकत हैं, एंजाइमन का अप-रेगुलेट कइके जवन विशेष रूप से धमनीकाठिन्य का उत्तेजित करत हैं। चयापचय पुनर्व्यवस्था कैंसर कोशिका के एक सामान्य विशेषता है, जेहिमा से कुछ कम करै वाले समकक्षन का उत्पादन करै के लिए टीसीए चक्र मध्यवर्ती के पूरक के रूप मा ग्लूटामाइन पर निर्भर करत हैं, जवन श्वसन श्रृंखला का चलावत हैं अऊर लिपिड अऊर न्यूक्लियोटाइड जैव संश्लेषण अग्रदूतन के उत्पादन का बनाए रखत हैं (39 , 40)। एक हालिया अध्ययन से पता चला है कि OXPHOS शिथिलता का अनुभव करै वाले परिधीय ऊतकों मा, ग्लूटामाइन / ग्लूटामेट चयापचय का पुनर्संयोजन भी एक प्रमुख विशेषता है (5, 41), जहां टीसीए चक्र मा ग्लूटामाइन प्रवेश के दिशा OXPHOS चोट के गंभीरता के कारण (41) पर निर्भर करत है। ). हालांकि, शरीर मा न्यूरोनल चयापचय प्लास्टिसिटी के कौनो समानता अऊर रोग के संदर्भ मा ओकर संभावित प्रासंगिकता के बारे मा स्पष्ट साक्ष्य के कमी है। एक ताजा इन विट्रो अध्ययन मा, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन्स का न्यूरोट्रांसमिशन के लिए ग्लूटामेट पूल का लामबंद करै के लिए देखा गा रहा, जेहिसे चयापचय तनाव के स्थिति मा ऑक्सीडेटिव चयापचय अऊर एथेरोस्क्लेरोसिस का बढ़ावा मिलत रहा (42)। ई ध्यान देय लायक है कि टीसीए चक्र एंजाइम सुक्सीनेट डिहाइड्रोजेनेज के औषधीय निषेध के तहत, पाइरूवेट कार्बोक्सिलेशन का संवर्धित सेरिबेलर ग्रैन्यूल न्यूरॉन्स (34) मा ऑक्सालोएसीटेट के संश्लेषण का बनाए रखै के लिए माना जात है। हालांकि, मस्तिष्क ऊतक (जहाँ एथेरोस्क्लेरोसिस मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स तक सीमित माना जात है) के लिए इन तंत्रन के शारीरिक प्रासंगिकता अभी भी महत्वपूर्ण शारीरिक महत्व रखत है (43)। यहि मामला मा, हमार डेटा से पता चलत है कि शरीर मा OXPHOS से क्षतिग्रस्त पीएन का बीसीएए अपघटन अऊर पाइरूवेट कार्बोक्सीलेशन मा बदला जा सकत है, जवन टीसीए पूल मध्यवर्ती के पूरकता के दुई मुख्य स्रोत हैं। यद्यपि न्यूरोनल ऊर्जा चयापचय मा बीसीएए अपचय का संभावित योगदान प्रस्तावित कीन गा है, न्यूरोट्रांसमिशन (44) के लिए ग्लूटामेट अऊर जीएबीए के भूमिका के अलावा, विवो मा इन तंत्रन के लिए अभी भी कौनो सबूत नाहीं है। यहिसे, ई अनुमान लगावै आसान है कि अकार्यशील पीएन एथेरोस्क्लेरोसिस का बढ़ावै से आत्मसात प्रक्रिया से संचालित टीसीए मध्यवर्ती के खपत के लिए स्वचालित रूप से क्षतिपूर्ति कर सकत हैं। विशेष रूप से, एस्पार्टिक एसिड के बढ़त मांग का बनाए रखे के लिए पीसीएक्स के अपरेग्यूलेशन के आवश्यकता हो सकत है, जेका माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन (45) के साथ प्रसारित कोशिका मा देखा गा है। हालांकि, हमार मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण से Mfn2cKO PNs (चित्र S6A) मा एस्पारटिक एसिड के स्थिर-अवस्था स्तर मा कौनो महत्वपूर्ण बदलाव नाहीं देखा गा, जवन संभवतः प्रसारित कोशिका अऊर पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स के बीच एस्पारटिक एसिड के अलग-अलग चयापचय उपयोग का दर्शाता है। यद्यपि विवो मा अकार्यात्मक न्यूरॉन्स मा पीसीएक्स अपरेग्यूलेशन के सटीक तंत्र के विशेषता बतावै के बाकी है, हमने देखावा कि ई समय से पहिले प्रतिक्रिया न्यूरॉन्स के रेडॉक्स स्थिति का बनाए रखै मा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभात है, जेका सेरिबैलर स्लाइस पर एफएलआईएम प्रयोगन मा देखावा गा रहा। विशेष रूप से, पीएन का पीसीएक्स का अप-रेगुलेट करै से रोकै से एक अउर ऑक्सीकृत अवस्था होइ सकत है अऊर कोशिका मृत्यु मा तेजी आ सकत है। बीसीएए अपघटन अऊर पाइरूवेट के कार्बोक्सीलेशन के सक्रियण माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन (7) के परिधीय ऊतकों के चिह्नित करै के तरीका नाहीं हैं। यहिसे, उ OXPHOS-कमी वाले न्यूरॉन्स के प्राथमिकता विशेषता लागत हैं, भले ही एकमात्र विशेषता न हो, जवन न्यूरोडिजनरेशन के लिए महत्वपूर्ण है। .
सेरिबेलर रोग एक विषम प्रकार का न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग है जवन आमतौर पर एटैक्सिया के रूप मा प्रकट होत है अऊर अक्सर पीएन (46) का नुकसान पहुँचावत है। ई न्यूरॉन आबादी माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के लिए विशेष रूप से कमजोर है काहे से कि चूहों मा ओनके चयनात्मक अपघटन मानव स्पाइनोसेरेबेलर एटैक्सिया (16, 47, 48) के विशेषता वाले कईयो मोटर लक्षणन का पुन: उत्पन्न करै के लिए पर्याप्त है। रिपोर्ट के अनुसार, एक उत्परिवर्ती जीन के साथ एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मानव स्पाइनोसेरेबेलर एटैक्सिया से जुड़ा अहै अऊर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन (49, 50) है, जवन पीएनपीएच मा ओएक्सपीएचओएस कमी के परिणामन के अध्ययन करै के महत्व पर जोर देत है। यहिसे, ई अद्वितीय न्यूरॉन आबादी का प्रभावी ढंग से अलग करै अऊर अध्ययन करै के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है। हालांकि, ई देखत हुए कि पीएन दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील हैं अऊर पूरे सेरिबैलर कोशिका आबादी के कम अनुपात के लिए जिम्मेदार हैं, कईयो ओमिक्स-आधारित अध्ययनन के लिए, पूरे कोशिका के रूप मा ओनके चयनात्मक पृथक्करण अभी भी एक चुनौतीपूर्ण पहलू है। यद्यपि अन्य कोशिका प्रकारन (विशेष रूप से वयस्क ऊतकों) के संदूषण के पूर्ण कमी प्राप्त करब लगभग असंभव है, हमने डाउनस्ट्रीम प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या मा व्यवहारिक न्यूरॉन्स प्राप्त करै के लिए एफएसीएस के साथ एक प्रभावी पृथक्करण चरण का जोड़ा, अऊर पूरे सेरिबैलम डेटा सेट के तुलना मा काफी उच्च प्रोटीन कवरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) है (151)। पूरी कोशिका के व्यवहार्यता का संरक्षित कइके, हम इहाँ प्रदान करत हैं विधि हमका न केवल माइटोकॉन्ड्रिया मा चयापचय मार्गन मा परिवर्तनन के जांच करै के अनुमति देत है, बल्कि अपने कोशिका द्रव्य समकक्षन मा परिवर्तनन के जांच करै के भी अनुमति देत है, जवन कोशिका प्रकारन के विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली लेबल संवर्धन के उपयोग के पूरक है। हम जवन विधि वर्णित करत हैं ऊ न केवल पुर्किन्जे कोशिका के अध्ययन से संबंधित है, बल्कि माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के अन्य मॉडल सहित रोगग्रस्त मस्तिष्क मा चयापचय परिवर्तनन का संबोधित करै के लिए कौनो भी प्रकार के कोशिका पर आसानी से लागू कीन जा सकत है।
अंत मा, हमने ई चयापचय पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया के दौरान एक चिकित्सीय खिड़की के पहचान कीन है जवन सेलुलर तनाव के प्रमुख संकेतन का पूरी तरह से उलट सकत है अऊर न्यूरोनल अपघटन का रोक सकत है। यहिसे, हिंया वर्णित रीवायरिंग के कार्यात्मक निहितार्थन का समझै से माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन के दौरान न्यूरोनल व्यवहार्यता का बनाए रखै के लिए संभावित उपचारन मा मौलिक अंतर्दृष्टि मिल सकत है। अन्य मस्तिष्क कोशिका प्रकारन मा ऊर्जा चयापचय मा परिवर्तनन का विच्छेदित करै के उद्देश्य से भविष्य के शोध के जरूरत है ताकि अन्य न्यूरोलॉजिकल रोगन मा ई सिद्धांत के प्रयोज्यता का पूरा तरह से प्रकट कीन जा सके।
माइटोपार्क चूहों का वर्णन पहिले कीन गा है (31)। loxP फ्लैंकिंग Mfn2 जीन वाले C57BL/6N चूहों का पहिले वर्णन कीन गा है (18) अऊर L7-Cre चूहों (23) के साथ पार कीन गा है। परिणामी डबल विषमयुग्मजी संतान का तब होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP चूहों के साथ पार कीन गा रहा ताकि Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) के लिए पुरकिन्जे-विशिष्ट जीन नॉकआउट उत्पन्न कीन जा सके। संभोग के एक सबसेट मा, जीटी (आरओएसए26) सोरस्टॉप-मिटो-वाईएफपी एलील (स्टॉप-एमटीवाईएफपी) का अतिरिक्त क्रॉस (20) के माध्यम से पेश कीन गा रहा। सब पशु प्रक्रिया यूरोपीय, राष्ट्रीय अऊर संस्थागत दिशानिर्देशन के अनुसार कीन गै रहीं अऊर जर्मनी के नॉर्थ राइन-वेस्टफेलिया के उमवेल्ट अऊर वर्ब्राउचेरशुट्ज़ के लैंडसमटफुरनेटुर द्वारा अनुमोदित कीन गै रहीं। पशु काम यूरोपीय प्रयोगशाला पशु विज्ञान संघन के महासंघ के मार्गदर्शन का भी पालन करत है।
गर्भवती महिला के गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन का संवेदनाहारी करै के बाद, माउस भ्रूण का अलग कीन जात है (ई13)। कॉर्टेक्स का 10 एमएम हेपेज के साथ पूरक हैंक्स के संतुलित नमक घोल (एचबीएसएस) मा विच्छेदित कीन गा रहा अऊर डुलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम मा पपेन (20 यू/एमएल) अऊर सिस्टीन (1μg/एमएल) युक्त पारित कीन गा रहा। डीएमईएम मा ऊतक का ऊष्मायन करा) अऊर एंजाइमी पाचन द्वारा ओका अलग करा। एमएल) 20 मिनट के लिए 37°C पर, अऊर फिर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक डीएमईएम में यांत्रिक रूप से पिसा। कोशिका इमेजिंग विश्लेषण के लिए 2×106 प्रति 6 सेमी कल्चर डिश के घनत्व पर या 0.5×105 कोशिका / सेमी2 के घनत्व पर पॉलीलिसिन से लेपित ग्लास कवरस्लिप्स पर बोई गईं। घंटे के बाद, माध्यम का न्यूरोबेसल सीरम-मुक्त माध्यम से बदला गा रहा जेहिमा 1% बी 27 पूरक अऊर 0.5 एमएम ग्लूटामैक्स रहा। तब न्यूरॉन्स का पूरे प्रयोग के दौरान 37°C अऊर 5% CO2 पर बनाए रखा गा रहा, अऊर सप्ताह मा एक बार खिलावा गा रहा। इन विट्रो मा पुनर्संयोजन का प्रेरित करै के खातिर, निम्नलिखित AAV9 वायरस वेक्टर के 3μl (24-वेल कल्चर डिश) या 0.5μl (24-वेल प्लेट) का उपयोग इन विट्रो मा दूसरे दिन न्यूरॉन्स के इलाज के लिए कीन गा रहा: AAV9.CMV.PI.eGFP। डब्ल्यूपीआरई.बीजीएच (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105530-एएवी9) अऊर एएवी9.सीएमवी.एचआई.ईजीएफपी-सीआरई.डब्ल्यूपीआरई.एसवी40 (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105545-एएवी9)।
माउस Mfn1 अऊर Mfn2 पूरक डीएनए (क्रमशः Addgene प्लास्मिड #23212 अऊर #23213 से प्राप्त) सी-टर्मिनस पर V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) के साथ चिह्नित कीन जात हैं, अऊर T2A अनुक्रम के माध्यम से फ्रेम मा mCherry के साथ फ्यूज कीन जात हैं। Grx1-roGFP2 हाइडलबर्ग टीपी डिक डीएफकेजेड (ड्यूशस क्रेब्सफोर्सचुंग्सजेंट्रम) का एक उपहार है। पारंपरिक क्लोनिंग विधियन का उपयोग कइके tdTomato कैसेट का बदल के, कैसेट का pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बैकबोन (एडजीन संदर्भ संख्या 28306) मा उपक्लोन कीन गा रहा ताकि pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G फ्लेक्स-एमचेरी-टी2ए-एमएफएन1-वी5 अऊर पीएएवी-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-आरओजीएफपी2 वैक्टर। नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry उत्पन्न करै के लिए एक समान रणनीति का उपयोग कीन गा रहा। In order to generate the AAV-shPCx construct, a plasmid AAV vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) is required, which contains the DNA sequence encoding the shRNA targeting mouse PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) यू 6 प्रमोटर के नियंत्रण मा, एमचेरी का उपयोग सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण मा कीन जात है। सहायक एएवी वैक्टरन का उत्पादन निर्माता के निर्देशन (सेल बायोलैब्स) के अनुसार कीन गा रहा। संक्षेप मा, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) का क्षणिक रूप से ले जाय वाला एक स्थानांतरण प्लास्मिड का उपयोग करा। एमचेरी (पीएएवी-सीएजी-फ्लेक्स-एमचेरी) या जीआरएवी-आरओजीएफपी 2 (पीएएवी-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-आरओजीएफपी 2) कोडिंग जीन, साथ ही कोडिंग एएवी 1 कैप्सिड प्रोटीन अऊर सहायक प्रोटीन पैकेजिंग प्लास्मिड प्लास्मिड, कैल्शियम फॉस्फेट विधि का उपयोग करत है। कच्चा वायरस सुपरनेटेंट एक सूखी बर्फ/इथेनॉल स्नान मा फ्रीज-थॉ चक्र अऊर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) मा कोशिकाओं का लाइज्ड द्वारा प्राप्त कीन गा रहा। एएवी वेक्टर का असतत आयोडिक्सनॉल ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (32,000 आरपीएम अऊर 4°C पर 24 घंटा) से शुद्ध कीन गा रहा अऊर एक एमिकॉन अल्ट्रा-15 सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर का उपयोग कइके केंद्रित कीन गा रहा। एएवी1-सीएजी-फ्लेक्स-एमचेरी-टी2ए-एमएफएन2-वी5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (जीसी)/एमएल], एएवी1-सीएजी-फ्लेक्स-एमचेरी (6.1×1012 जीसी/एमएल), एएवी1-सीएजी-फ्लेक्स का जीनोम टाइटर पहिले वर्णित (पीसीआर-क्यू) द्वारा वास्तविक समय मापा गा रहा (54) -एमएफएन1-वी5 (1.9×1013 जीसी/एमएल) अऊर एएवी1-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-आरओजीएफपी2 (8.9×1012 जीसी/एमएल)।
प्राथमिक न्यूरॉन्स का बर्फ-ठंडा 1x पीबीएस मा खुरच के हटावा गा रहा, गोली बनावा गा रहा, अऊर फिर 0.5% ट्राइटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डीऑक्सीकोलेट/पीबीएस लाइसिस बफर मा समरूप बनावा गा रहा जेहिमा फॉस्फेटेज अऊर प्रोटीज अवरोधक (रोचे) रहा। बाइसिन्कोनिनिक एसिड परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग कइके प्रोटीन के मात्रा निर्धारण कीन गा रहा। तब प्रोटीन का एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग कीन गा रहा, अऊर फिर एक पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली (जीई हेल्थकेयर) पर धब्बा लगावा गा रहा। गैर-विशिष्ट साइटन का अवरुद्ध करा अऊर टीबीएसटी (ट्वीन के साथ ट्रिस-बफर खारा) मा 5% दूध मा प्राथमिक एंटीबॉडी (विवरण के लिए तालिका एस 1 देखौ) के साथ ऊष्मायन करा, धोवै के चरण अऊर टीबीएसटी इनक्यूबेट मा द्वितीयक एंटीबॉडी। +4°C पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन करा। धोवै के बाद, कमरा के तापमान पर 2 घंटा के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी लगावा जाय। बाद मा, एक एंटी-β-एक्टिन एंटीबॉडी के साथ एकै धब्बा का ऊष्मायन कइके, एकै लोडिंग के पुष्टि कीन गै। केमिलुमिनेसेंस मा बदल के अऊर केमिलुमिनेसेंस (जीई हेल्थकेयर) का बढ़ावै से पता लगावै।
ग्लास कवरस्लिप्स पर पहिले बोए गए न्यूरॉन्स का 10 मिनट के लिए कमरा के तापमान पर निर्दिष्ट समय बिंदु पर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) / पीबीएस के साथ तय कीन गा रहा। कवरस्लिप्स का पहिले कमरा के तापमान पर 5 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के साथ व्याप्त कीन जात है, अऊर फिर अवरुद्ध बफर [3% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए)/पीबीएस] मा। दूसरे दिन, कवरस्लिप्स का अवरुद्ध बफर से धोवा गा अऊर कमरा के तापमान पर 2 घंटा के लिए उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन करा गा; अंत मा, नमूना 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ पीबीएस मा अच्छी तरह से धोवा गा रहा अऊर फिर एक्वा-पॉली/माउंट के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर तय कीन गा रहा।
चूहों (नर अऊर मादा) का केटामाइन (130 मिलीग्राम/किलोग्राम) अऊर जाइलाज़िन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से बेहोश कीन गा रहा अऊर कार्प्रोफेन एनाल्जेसिक (5 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ चमड़ी के नीचे नियंत्रित कीन गा रहा, अऊर एक वार्म से सुसज्जित एक स्टीरियोटैक्टिक उपकरण (कोपफ) मा रखा गा रहा। खोपड़ी का उजागर करा अऊर मिस हड्डी (लैम्ब्डा से: पूंछ 1.8, पार्श्व 1, लोब्यूल्स IV अऊर V के अनुरूप) सेरिबैलर कॉर्टेक्स के हिस्सा का पतला करै के लिए एक दंत ड्रिल का उपयोग करा। नीचे के संवहनी तंत्र का बाधित करै से बचे के लिए खोपड़ी मा एक छोट छेद सावधानी से बनावै के लिए एक घुमावदार सिरिंज सुई का उपयोग करा। फिर पतली खींचा गा कांच के केशिका का धीरे-धीरे माइक्रो-होल (ड्यूरा मेटर के उदर पक्ष पर -1.3 से -1 तक) मा डाला जात है, अऊर 200 से 300 एनएल एएवी का 200 से 300 एनएल एएवी का माइक्रो-इंजेक्टर (नारिशिगे) मा मैनुअल सिरिंज (नारिशिगे) के साथ 20 से 20 मिनट के समय अवधि मा कम दबाव मा कई बार इंजेक्ट कीन जात है। जलसेक के बाद, केशिका का 10 मिनट अउर रखौ ताकि वायरस पूरा तरह से फैल सकै। केशिकाओं का वापस लेवे के बाद, घाव के सूजन का कम करै अऊर जानवर का ठीक करै के अनुमति देय के लिए त्वचा का सावधानी से सिलाई कीन जात है। ऑपरेशन के बाद कई दिनन तक जानवरन का एनाल्जेसिक (कैस्पोफेन) से इलाज कीन गा रहा, जेहिके दौरान ओनके शारीरिक स्थिति के सावधानी से निगरानी कीन गा रहा अऊर फिर बतावा गा समय बिंदु पर ओनका यूथनाइज़ कीन गा रहा। सब प्रक्रिया यूरोपीय, राष्ट्रीय अऊर संस्थागत दिशानिर्देशन के अनुसार कीन गै रहीं अऊर जर्मनी के नॉर्थ राइन-वेस्टफेलिया के उमवेल्ट अऊर वर्ब्राउचेरशुट्ज़ के लैंडसमटफुरनेचर द्वारा अनुमोदित कीन गै रहीं।
जानवरन का केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) अऊर जाइलाजिन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) से संवेदनाहारी कीन गा रहा, अऊर हृदय का पहिले 0.1 एम पीबीएस से अऊर फिर पीबीएस मा 4% पीएफए ​​से संचारित कीन गा रहा। ऊतक का विच्छेदित कीन गा रहा अऊर 4°C पर रात भर 4% पीएफए/पीबीएस मा तय कीन गा रहा। पीबीएस मा निश्चित मस्तिष्क से धनु खंड (50 माइक्रोन मोटी) तैयार करै के लिए एक कंपन चाकू (लीका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) का उपयोग कीन गा रहा। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न कीन जाय, मुक्त-तैरते खंडन का धुंधलापन कमरा के तापमान अऊर सरगर्मी पर ऊपर वर्णित (13) के अनुसार कीन गा रहा। संक्षेप मा, सबसे पहिले, प्राप्त स्लाइस का कमरा के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के साथ पारगम्य बनावा गा रहा; कुछ एपिटोप्स (Pcx अऊर Shmt2) के लिए, 80°C (PH 9) पर ट्रिस-ईडीटीए बफर मा यहि चरण के बजाय 25 मिनट तक स्लाइस का गरम करा। अगला, खंडन का प्राथमिक एंटीबॉडी (देखें तालिका S1) के साथ ब्लॉकिंग बफर (3% बीएसए / पीबीएस) मा 4°C पर रात भर सरगर्मी के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। अगले दिन, खंडन का अवरुद्ध बफर से धोवा गा अऊर कमरा के तापमान पर 2 घंटा के लिए उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन करा गा; अंत मा, खंडन का पीबीएस मा अच्छी तरह से धोवा गा, डीएपीआई से काउंटर-स्टेन कीन गा, अऊर फिर एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पै एक्वापॉलीमाउंट से तय कीन गा।
नमूना के छवि बनावै के लिए एक सफेद रोशनी लेजर अऊर 405 डायोड पराबैंगनी लेजर से सुसज्जित एक लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी8-एक्स या टीसीएस डिजिटल लाइट शीट, लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग कीन गा रहा। फ्लोरोफोर का उत्तेजित कइके अऊर हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) के साथ संकेत एकत्र कइके, LAS-X सॉफ्टवेयर का उपयोग अनुक्रमिक मोड मा न्यक्विस्ट नमूनाकरण के अनुरूप ढेर छवियन का एकत्र करै के लिए कीन गा रहा: गैर-मात्रात्मक पैनलन के लिए, ई अत्यधिक गतिशील संकेत (उदाहरण के लिए, दैहिक कोशिका अऊर डेंड्राइट्स मा) है मोड)। पृष्ठभूमि का कम करै के लिए 0.3 से 6 एनएस के गेटिंग लागू कीन जात है।
क्रमबद्ध कोशिकाओं का वास्तविक समय इमेजिंग। 1% बी 27 पूरक अऊर 0.5 एमएम ग्लूटामैक्स युक्त न्यूरोबेसल-ए माध्यम मा छँटाई के बाद, कोशिका तुरंत पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास स्लाइड्स (μ-स्लाइड8 खैर, इबिडी, कैटलॉग नंबर 80826) पर बीज लगावा गा रहा, अऊर फिर कोशिका का 37°C अऊर 25% सीओ पर रखवा गा रहा। निपटब। एक सफेद लेजर, एचआईडी, 63 × [1.4 संख्यात्मक एपर्चर (एनए)] ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस अऊर एक हीटिंग स्टेज से सुसज्जित लीका एसपी 8 लेजर स्कैनिंग कन्फोकल माइक्रोस्कोप पर वास्तविक समय इमेजिंग कीन गै रही।
माउस का कार्बन डाइऑक्साइड से जल्दी से बेहोश कीन गा अऊर सिर काट दीन गा, मस्तिष्क का खोपड़ी से जल्दी से हटावा गा, अऊर 200 माइक्रोन मोटी (13C लेबलिंग प्रयोग के लिए) या 275 माइक्रोन मोटी (दुई फोटॉन प्रयोगन के लिए) धनु खंड मा काट दीन गा जवन निम्नलिखित सामग्री से भरा रहा आइसक्रीम (HM-605, themoficific, themoficifics, V वालडॉर्फ, जर्मनी) निम्नलिखित पदार्थन से भरा अहै: 125 एमएम बर्फ-ठंडा, कार्बन-संतृप्त (95% ओ 2 अऊर 5% सीओ 2) कम सीए 2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (एसीएसएफ) एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, एमसीओएच एमएम 25 एमएम, ग्लूज 0.5 एमएम सीएसीएल2 अऊर 3.5 एमएम एमजीसीएल2 (310 से 330 एमएमओएल का आसमाटिक दबाव)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस का एक पूर्व-ऊष्मायन कक्ष मा स्थानांतरित करा जेहिमा उच्च Ca2 + ACSF (125.0 एमएम NaCl, 2.5 एमएम KCl, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 एमएम NaHCO3, 25.0 एमएम डी-ग्लूकोज, 10 एमएम सीएएल अऊर 20 एमएम सीएएल) हो। MgCl2) माध्यम) पीएच 7.4 अऊर 310 से 320 एमएमओएल)।
इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस का एक समर्पित इमेजिंग कक्ष मा स्थानांतरित कीन गा रहा, अऊर प्रयोग 32° से 33°C के स्थिर तापमान पर निरंतर एसीएसएफ छिड़काव के तहत कीन गा रहा। स्लाइस इमेजिंग के लिए एक मल्टीफोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (टीसीएस एसपी 8 एमपी-ओपीओ, लीका माइक्रोसिस्टम्स) का उपयोग लीका 25x ऑब्जेक्टिव लेंस (एनए 0.95, पानी), टीआई: सैफायर लेजर (गिरगिट विजन II, कोहेरेंट) से सुसज्जित कीन गा रहा। एफएलआईएम मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट)।
Grx1-roGFP2 का FLIM। पीएन के कोशिका द्रव्य रेडॉक्स अवस्था मा बदलाव का धनु मस्तिष्क स्लाइस मा दुई-फोटॉन एफएलआईएम द्वारा मापा गा रहा, जहां जीआरएक्स 1-आरओजीएफपी 2 बायोसेंसर पीएन का लक्षित करत रहा। पीएन परत मा, अधिग्रहण क्षेत्र का स्लाइस सतह से लगभग 50 से 80 माइक्रोन नीचे चुना जात है ताकि ई सुनिश्चित कीन जा सके कि एक व्यवहारिक पीएन (यानी, डेंड्राइट्स के साथ मनके संरचना या न्यूरोनल रूपात्मक परिवर्तनन के कमी) अऊर डबल पॉजिटिव आरओजीएफपी 2 सेंसर अऊर एएवी एन्कोडिंग एसएचआरएनए पीसीएक्स या ओकर अनुक्रम नियंत्रित करत है (प्रत्येक एमसीसीएक्सप्रेसिंग सह-अभिव्यक्ति)। 2x डिजिटल ज़ूम [उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 890 एनएम; 512 एनएम 512 पिक्सेल]। पता लगावै: आंतरिक एचआईडी, फ्लोरोसेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) फिल्टर समूह] अऊर 2 से 3 मिनट के भीतर छवि औसतन का उपयोग ई सुनिश्चित करै के लिए कीन जात है कि वक्र फिटिंग के लिए पर्याप्त फोटॉन (कुल 1000 फोटॉन) एकत्रित कीन जात हैं। Grx1-roGFP2 जांच के संवेदनशीलता अऊर FLIM स्थितियन के सत्यापन roGFP2 के जीवन काल मान के निगरानी कइके कीन गा रहा जब छिड़काव ACSF मा बहिर्जात 10 एमएम H2O2 जोड़ा जात रहा (ऑक्सीकरण का अधिकतम करै के लिए, जेकरे परिणामस्वरूप जीवन काल बढ़ जात है), अऊर फिर 2 एमएम डाइथियोथ्रिट जोड़ै से (जिणके परिणामस्वरूप कमी के डिग्री कम होत है, जीवन काल मा कमी) (चित्र एस 8, डी से जी)। अधिग्रहित परिणामन का विश्लेषण करै के लिए FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेयर का उपयोग करा, मापा IRF (इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन) मा पूरी छवि के एकल घातीय क्षय वक्र का फिट करा, अऊर χ2 लगभग 1 है। एकल PN के जीवनकाल के गणना करै के लिए, तंत्रिका शरीर के चारों ओर मास्क का मैन्युअल रूप से खींचा गा रहा, हर मास्क मा जीवनकाल के औसत माप का उपयोग कीन गा रहा।
माइटोकॉन्ड्रियल विभव विश्लेषण। तीव्र खंड का 100 एनएम टीएमआरएम के साथ सीधे 30 मिनट के लिए संचारित एसीएसएफ में जोड़ा जाय के बाद, पीएन के माइटोकॉन्ड्रियल संभावित परिवर्तनन का एक दुई-फोटॉन माइक्रोस्कोप द्वारा मापा गा रहा। टीएमआरएम इमेजिंग 920 एनएम पर जांच का उत्तेजित कइके अऊर संकेत एकत्र करै के लिए आंतरिक एचआईडी (टेट्रामेथिलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट: 585/40 एनएम) का उपयोग कइके कीन गा रहा; एकै उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का उपयोग कइके लेकिन mtYFP का छवि बनावै के लिए एक अलग आंतरिक HyD (FITC :525/50) का उपयोग कइके। एकल कोशिका स्तर पर माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता का मूल्यांकन करै के लिए इमेजजे के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन का उपयोग करा। संक्षेप मा, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = मिनट (mtYFP, TMRM) का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र के पहचान करै के लिए कीन जात है जवन संबंधित चैनल के एकल-स्टैक कन्फोकल छवि मा पुर्किंज सोमाली मा TMRM सिग्नल देखावत है। फिर परिणामी मास्क मा पिक्सेल क्षेत्र का मापा जात है, अऊर फिर माइटोकॉन्ड्रियल क्षमता का देखावै वाले माइटोकॉन्ड्रियल अंश प्राप्त करै के लिए mtYFP चैनल के संबंधित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्टैक छवि पर सामान्यीकृत कीन जात है।
छवि का ह्यूजेंस प्रो (वैज्ञानिक वॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेयर से विघटित कीन गा रहा। टाइल्स के स्कैन कीन गा चित्रन के लिए, एकल टाइल का मोंटेज LAS-X सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान कीन गा स्वचालित सिलाई एल्गोरिदम का उपयोग कइके बनावा जात है। छवि अंशांकन के बाद, छवि का अउर संसाधित करै अऊर चमक अऊर विपरीतता का समान रूप से समायोजित करै के लिए इमेजजे अऊर एडोब फोटोशॉप का उपयोग करा। ग्राफिक तैयारी के लिए एडोब इलस्ट्रेटर का उपयोग करा।
एमटीडीएनए फोकस विश्लेषण। एमटीडीएनए घावन के संख्या का कन्फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा डीएनए के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए सेरिबैलर खंडन पर मापा गा रहा। प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र कोशिका शरीर अऊर प्रत्येक कोशिका के नाभिक के लिए बनावा गा रहा, अऊर संबंधित क्षेत्र के गणना मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) का उपयोग कइके कीन गा रहा। कोशिका द्रव्य क्षेत्र प्राप्त करै के लिए कोशिका शरीर क्षेत्र से परमाणु क्षेत्र घटावा जाय। अंत मा, विश्लेषण कण प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) का उपयोग थ्रेसहोल्ड छवि पर एमटीडीएनए का इंगित करै वाले कोशिका द्रव्य डीएनए बिंदुओं का स्वचालित रूप से मापे के लिए कीन गा रहा, अऊर प्राप्त परिणामन का सीटीआरएल चूहों के पीएन औसत के लिए सामान्यीकृत कीन गा रहा। परिणाम प्रति कोशिका न्यूक्लियोसाइड्स के औसत संख्या के रूप मा व्यक्त कीन जात हैं।
प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। एकल कोशिका स्तर पर पीएन मा प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करै के लिए इमेजजे के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन का उपयोग करा। संक्षेप मा, संबंधित चैनल के एकल-परत कन्फोकल छवि मा, समीकरण के माध्यम से: संकेत = मिनट (एमटीवाईएफपी, एंटीबॉडी), माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र जवन पुर्किना मा एक निश्चित एंटीबॉडी के लिए इम्यूनोरिएक्टिविटी देखावत है, पहचाना जात है। फिर परिणामी मास्क मा पिक्सेल क्षेत्र का मापा जात है, अऊर फिर प्रदर्शित प्रोटीन के माइटोकॉन्ड्रियल अंश प्राप्त करै के लिए mtYFP चैनल के संबंधित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्टैक छवि पर सामान्यीकृत कीन जात है।
पुर्किन्जे कोशिका घनत्व विश्लेषण। इमेजजे के सेल काउंटर प्लग-इन का उपयोग गिने गए कोशिकाओं द्वारा कब्जा कीन गा सेरिबैलर रिंग के लंबाई से गिने गए पुर्किन्जे कोशिकाओं के संख्या का विभाजित कइके पुर्किन्जे घनत्व का मूल्यांकन करै के लिए कीन गा रहा।
नमूना तैयारी अऊर संग्रह। नियंत्रण समूह अऊर Mfn2cKO चूहों के दिमाग का 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) मा 2% पीएफए/2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड मा तय कीन गा रहा, अऊर फिर सिलिअट्स (लीका माइक्रोसिस्टम जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) (मोटाई 50 से 60 माइक्रोन) का उपयोग कइके कोरोनल अनुभाग तैयार कीन गा रहा। टेट्राऑक्साइड अऊर 1.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड का कमरा के तापमान पर 1 घंटा के लिए। खंडन का आसुत जल से तीन बार धोवा गा रहा, अऊर फिर 20 मिनट के लिए 1% यूरेनिल एसीटेट युक्त 70% इथेनॉल से दाग दीन गा रहा। तब खंडन का ग्रेडेड अल्कोहल मा निर्जलित कीन गा अऊर सिलिकॉन-लेपित ग्लास स्लाइड्स के बीच डर्कुपन एसीएम (अराल्डाइट कास्टिंग रेजिन एम) एपोक्सी रेजिन (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, कैटलॉग नंबर 14040) मा एम्बेडेड कीन गा, अऊर अंत मा 60°C पर 48 घंटा के लिए ओवन मा बहुलक बनावा गा। सेरिबेलर कॉर्टेक्स क्षेत्र का चयन कीन गा रहा अऊर 50 एनएम अल्ट्राथिन खंडन का लीका अल्ट्राकट (लीका माइक्रोसिस्टम जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) पर काटा गा रहा अऊर पॉलीस्टायरीन फिल्म से लेपित 2×1 मिमी तांबा स्लिट ग्रिड पर उठावा गा रहा। खंडन का 10 मिनट के लिए एच 2 ओ मा 4% यूरेनिल एसीटेट के घोल से दाग दीन गा रहा, कई बार एच 2 ओ से धोवा गा रहा, फिर 10 मिनट के लिए एच 2 ओ मा रेनॉल्ड्स लीड साइट्रेट के साथ धोवा गा रहा, अऊर फिर कई बार एच 2 ओ से धोवा गा रहा। माइक्रोग्राफ एक टीवीआईपीएस (टाइट्ज़ वीडियो अऊर इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमकैम-एफ 416 डिजिटल कैमरा (टीवीआईपीएस जीएमबीएच, गौटिंग, यूएसए) का उपयोग कइके एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिलिप्स सीएम100 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, यूएसए) के साथ लीन गा रहा। जर्मनी)।
एएवी से संक्रमित चूहों के लिए, मस्तिष्क का अलग कीन गा रहा अऊर 1 मिमी मोटी धनु खंड मा काटा गा रहा, अऊर एएवी-संक्रमित रिंग (यानी, एमचेरी एक्सप्रेसिंग) के पहचान करै के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कइके सेरिबैलम के जांच कीन गा रहा। केवल उ प्रयोगन का उपयोग कीन जात है जेहिमा एएवी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कम से कम दुई लगातार सेरिबैलर रिंग मा पुर्किंज सेल परत (यानी लगभग पूरी परत) के बहुत उच्च संचरण दक्षता होत है। एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप का रात भर के पोस्ट-फिक्सेशन (0.1 एम कोकोट बफर मा 4% पीएफए ​​अऊर 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड) के लिए माइक्रोडिसेक्ट कीन गा रहा अऊर आगे संसाधित कीन गा रहा। ईपीओएन एम्बेडिंग के लिए, निश्चित ऊतक का 0.1 एम सोडियम कोकोट बफर (एप्लीकेम) से धोवा गा रहा, अऊर 0.1 एम सोडियम कोकोट बफर (एप्लीकेम) मा 2% ओएसओ4 (ओएस, साइंस सर्विसेज; काको) के साथ 4 घंटा तक ऊष्मायन करा गा रहा, फिर 2 घंटा तक धोवा गा रहा। 0.1 एम कोकामाइड बफर के साथ 3 बार दोहरावा। बाद मा, ऊतक का निर्जलित करै के लिए 15 मिनट के लिए 4°C पर प्रत्येक इथेनॉल घोल का ऊष्मायन करै के लिए इथेनॉल के आरोही श्रृंखला का उपयोग कीन गा रहा। ऊतक का प्रोपिलीन ऑक्साइड मा स्थानांतरित कीन गा रहा अऊर 4°C पर ईपीओएन (सिग्मा-एल्ड्रिच) मा रात भर ऊष्मायन करा गा रहा। ऊतक का 2 घंटा के लिए कमरा के तापमान पर ताजा ईपीओएन मा रखौ, अऊर फिर 72 घंटा के लिए 62°C पर एम्बेड करा। एनएम अल्ट्राथिन खंडन का काटै के लिए एक अल्ट्रामाइक्रोटोम (लीका माइक्रोसिस्टम्स, यूसी 6) अऊर एक हीरा चाकू (डायटोम, बील, स्विट्जरलैंड) का उपयोग करा, अऊर 37°C पर 15 मिनट के लिए 1.5% यूरेनिल एसीटेट से दाग लगावा, अऊर 4 मिनट तक सीसा साइट्रेट घोल से दाग लगावा। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कैमरा वनव्यू 4K 16-बिट (गटन) अऊर डिजिटल माइक्रोग्राफ सॉफ्टवेयर (गटन) से सुसज्जित जेईएम-2100 प्लस ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (जेईओएल) का उपयोग कइके लीन गा रहा। विश्लेषण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ 5000× या 10,000× डिजिटल जूम के साथ प्राप्त कीन गा रहें।
माइटोकॉन्ड्रिया का रूपात्मक विश्लेषण। सब विश्लेषणन के लिए, व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के रूपरेखा का इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग कइके डिजिटल छवियन मा मैन्युअल रूप से उल्लिखित कीन गा रहा। अलग-अलग रूपात्मक पैरामीटरन का विश्लेषण कीन जात है। माइटोकॉन्ड्रियल घनत्व का प्रत्येक कोशिका के कुल माइटोकॉन्ड्रियल क्षेत्र का कोशिका द्रव्य क्षेत्र (कोशिका क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-कोशिका नाभिक क्षेत्र) × 100 से विभाजित कइके प्राप्त प्रतिशत के रूप मा व्यक्त कीन जात है। माइटोकॉन्ड्रिया के गोलाई के गणना सूत्र [4π∙(क्षेत्रफल/परिमीटर 2)] से कीन जात है। माइटोकॉन्ड्रिया के इस्टा आकृति विज्ञान का विश्लेषण कीन गा रहा अऊर ओनके मुख्य आकार के अनुसार दुई श्रेणियन ("ट्यूबलर" अऊर "ब्लिस्टर") मा विभाजित कीन गा रहा।
ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संख्या अऊर घनत्व विश्लेषण। डिजिटल छवि मा प्रत्येक ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम के रूपरेखा का मैन्युअल रूप से रेखांकित करै के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करा। ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम क्षेत्र का एक प्रतिशत के रूप मा व्यक्त कीन जात है जेहिका प्रत्येक कोशिका के कुल ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्र का कोशिका द्रव्य क्षेत्र (कोशिका क्षेत्र=कोशिका क्षेत्र-नाभिक क्षेत्र)×100 से विभाजित कइके गणना कीन जात है। ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम के घनत्व के गणना कुल संख्या का प्रति कोशिका ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचनाओं के संख्या से विभाजित कइके कीन जात है (कोशिका द्रव्य क्षेत्र के संदर्भ मा) (कोशिका द्रव्य क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-परमाणु क्षेत्र)।
तीव्र अनुभाग अऊर नमूना तैयारी के लिए लेबलिंग। ग्लूकोज लेबलिंग के आवश्यकता वाले प्रयोगन के लिए, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का एक पूर्व-ऊष्मायन कक्ष मा स्थानांतरित करौ, जेहिमा संतृप्त कार्बन (95% O2 अऊर 5% CO2), उच्च Ca2 + ACSF (125.0 एमएम NaCl, 2.5 एमएम KCl, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 2.5 एमएम एमएम NaCl, 2.5 एमएम NaCl, 2.5 एमएम NaCl. डी-ग्लूकोज, 1.0 एमएम सीएसीएल 2 अऊर 2.0 एमएम एमजीसीएल 2, पीएच 7.4 अऊर 310 से 320 एमओएसएम तक समायोजित), जेहिमा ग्लूकोज 13 सी 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (यूरिसोटॉप, कैटलॉग नंबर सीएलएम-1396) है। पाइरूवेट लेबलिंग के आवश्यकता वाले प्रयोगन के लिए, तीव्र मस्तिष्क स्लाइस का उच्च Ca2 + ACSF (125.0 एमएम NaCl, 2.5 एमएम KCl, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 एमएम NaHCO3, 25.0 एमएम डी-ग्लूकोज, 10 एमएम सीएएल अऊर 20 एमएम एडीएमडी) मा स्थानांतरित करौ। MgCl2, पीएच 7.4 अऊर 310 से 320mOsm तक समायोजित करा), अऊर 1mM 1-[1-13C] पाइरूवेट (यूरिसोटॉप, कैटलॉग नंबर CLM-1082) जोड़ा। खंडन का 37°C पर 90 मिनट तक ऊष्मायन करा। प्रयोग के अंत मा, खंडन का 75 एमएम अमोनियम कार्बोनेट युक्त एक जलीय घोल (पीएच 7.4) से जल्दी से धोवा गा रहा, अऊर फिर 40:40:20 (v:v:v) एसीटोनाइट्रिल (एसीएन): मेथनॉल: पानी मा समरूप बनावा गा रहा। खंडन का 30 मिनट तक बर्फ पर ऊष्मायन करै के बाद, नमूना 4°C पर 10 मिनट के लिए 21,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा, अऊर स्पष्ट सुपरनेटेंट का स्पीडवैक सांद्रक मा सुखावा गा रहा। परिणामी सूखे चयापचय गोली का विश्लेषण तक -80°C पर संग्रहीत कीन गा रहा।
सी-लेबल अमीनो एसिड का तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषण के लिए, चयापचय गोली का एलसी-एमएस ग्रेड पानी (हनीवेल) के 75 μl मा फिर से निलंबित कीन गा रहा। 4°C पर 5 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, 20 μl स्पष्ट सुपरनेटेंट का अमीनो एसिड फ्लक्स विश्लेषण के लिए उपयोग कीन गा रहा, जबकि बाकी अर्क का तुरंत आयन विश्लेषण के लिए उपयोग कीन गा रहा (नीचे देखौ)। अमीनो एसिड विश्लेषण पहिले से वर्णित बेंजोइल क्लोराइड डेरिवेटाइजेशन प्रोटोकॉल (55, 56) का उपयोग कइके कीन गा रहा। पहिला चरण मा, 100 एमएम सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) के 10 μl का 20 μl चयापचय अर्क मा जोड़ा गा रहा, अऊर फिर 10 μl 2% बेंजोइल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) का एलसी ग्रेड एसीएन मा जोड़ा गा रहा। नमूना का संक्षेप मा भंवर बनावा गा रहा अऊर फिर 20°C पर 5 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। साफ कीन गा सुपरनेटेंट का एक शंक्वाकार ग्लास आवेषण (200 μl आयतन) के साथ 2 मिलीलीटर ऑटोसैम्पलर शीशी मा स्थानांतरित करा। नमूना का विश्लेषण एक्विटी आईक्लास अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस एलसी सिस्टम (वाटर्स) का उपयोग कइके कीन गा रहा जवन क्यू-एक्सैक्टिव (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाई फील्ड ऑर्बिट्रैप) हाई-रिज़ॉल्यूशन प्रेसिजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़ा रहा। विश्लेषण के लिए, व्युत्पन्न नमूना के 2μl का 100×1.0 मिमी उच्च-शक्ति सिलिका टी 3 कॉलम (वाटर्स) मा 1.8μm कण युक्त इंजेक्ट कीन गा रहा। प्रवाह दर 100μl/min है, अऊर बफर सिस्टम मा बफर ए (पानी मा 10 एमएम अमोनियम फॉर्मेट अऊर 0.15% फार्मिक एसिड) अऊर बफर बी (एसीएन) होत है। ढाल निम्नलिखित है: 0 मिनट मा 0%B; 0%B. 0 से 0.1 मिनट मा 0 से 15% बी; 15 से 17% बी 0.1 से 0.5 मिनट मा; बी 0.5 से 14 मिनट मा 17 से 55% पर; बी 14 से 14.5 मिनट मा 55 से 70% पर; मिनट मा 14.5 से 70 से 100% बी पर; से 19 मिनट मा 100% बी; 100 से 0% बी 19 से 19.1 मिनट मा; 0% बी 19.1 से 28 मिनट (55, 56) मा। क्यूई-एचएफ द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर 50 से 750 के एम/जेड (द्रव्यमान/आवेश अनुपात) के द्रव्यमान सीमा के साथ सकारात्मक आयनीकरण मोड मा काम करत है। लागू रिज़ॉल्यूशन 60,000 है, अऊर प्राप्त लाभ नियंत्रण (एजीसी) आयन लक्ष्य 3×106 है, अऊर अधिकतम आयन समय 100 मिलीसेकंड है। गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) स्रोत 3.5 केवी के स्प्रे वोल्टेज, 250 डिग्री सेल्सियस के केशिका तापमान, 60 एयू (मनमानी इकाइयन) के म्यान वायु प्रवाह अऊर 20 एयू के सहायक वायु प्रवाह पर काम करत है। 250°C एस लेंस 60 एयू पर सेट अहै।
13C लेबल कार्बनिक अम्ल का आयन क्रोमैटोग्राफी-एमएस विश्लेषण। शेष चयापचय अवक्षेप (55μl) का विश्लेषण एक डायोनेक्स आयन क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (आईसीएस 5000+, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग कइके कीन गा रहा जवन एक क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़ा रहा। संक्षेप मा, 5μl चयापचय अर्क का एक डायोनेक्स आयनपैक एएस11-एचसी कॉलम मा एचपीएलसी (2 मिमी × 250 मिमी, कण आकार 4 माइक्रोन, थर्मो फिशर साइंटिफिक) से सुसज्जित 1. )ऑन के भराई अनुपात के साथ पुश-इन आंशिक लूप मोड मा इंजेक्ट कीन गा रहा। डायोनेक्स आयनपैक एजी11-एचसी गार्ड कॉलम (2 मिमी x 50 मिमी, 4 माइक्रोन, थर्मो फिशर साइंटिफिक)। कॉलम तापमान 30°C पर बनाए रखा जात है, अऊर ऑटोसैंपलर 6°C पर सेट कीन जात है। एल्यूएंट जनरेटर के माध्यम से पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड ढाल उत्पन्न करै के लिए विआयनीकृत पानी के साथ प्रदान कीन गा पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड कारतूस का उपयोग करा। निम्नलिखित ढाल लागू करत हुए 380μl/min के प्रवाह दर पर चयापचयों का पृथक्करण: 0 से 3 मिनट, 10 एमएम केओएच; 3 से 12 मिनट, 10 से 50 एमएम केओएच; 12 से 19 मिनट, 50 से 100 एमएम केओएच; 19 से 21 मिनट, 100 एमएम केओएच; 21 से 21.5 मिनट, 100 से 10 एमएम केओएच। कॉलम का 8.5 मिनट के लिए 10 एमएम केओएच के तहत फिर से संतुलित कीन गा रहा।
एलुटेड मेटाबोलाइट्स का कॉलम के बाद 150μl/min आइसोप्रोपानॉल पूरक धारा के साथ जोड़ा जात है अऊर फिर नकारात्मक आयनीकरण मोड मा संचालित एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए निर्देशित कीन जात है। एमएस 60,000 के रिज़ॉल्यूशन के साथ एम/जेड 50 से 750 तक के द्रव्यमान सीमा के निगरानी करत है। एजीसी 1×106 पर सेट कीन गा है, अऊर अधिकतम आयन समय 100 एमएस पर रखा गा है। गरम ईएसआई स्रोत 3.5 केवी के स्प्रे वोल्टेज पर संचालित कीन जात रहा। आयन स्रोत के अन्य सेटिंग्स निम्नलिखित हैं: केशिका तापमान 275°C; म्यान गैस प्रवाह, 60 एयू; सहायक गैस प्रवाह, 300°C पर 20 AU, अऊर 60 AU पर एस लेंस सेटिंग।
13C लेबल वाले चयापचयों का डेटा विश्लेषण। समस्थानिक अनुपात के डेटा विश्लेषण के लिए ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करा। हर यौगिक के पहचान एक विश्वसनीय संदर्भ यौगिक द्वारा सत्यापित कीन गा रहा अऊर स्वतंत्र रूप से विश्लेषण कीन गा रहा। समस्थानिक संवर्धन विश्लेषण करै के खातिर, प्रत्येक 13C समस्थानिक (Mn) के निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) के क्षेत्रफल [M + H] + से निकाला गा रहा, जहां n लक्ष्य यौगिक के कार्बन संख्या है, जेका अमीनो एसिड के विश्लेषण करै के लिए उपयोग कीन जात है या [ MH] + का उपयोग आयनन के विश्लेषण करै के लिए कीन जात है। XIC के द्रव्यमान सटीकता प्रति मिलियन पांच भाग से कम है, अऊर RT के सटीकता 0.05 मिनट है। संवर्धन विश्लेषण संबंधित यौगिक के सब समस्थानिकन के योग से प्रत्येक पता लगावा गा समस्थानिक के अनुपात के गणना कइके कीन जात है। ई अनुपात प्रत्येक समस्थानिक के लिए प्रतिशत मान के रूप मा दीन जात हैं, अऊर परिणाम दाढ़ प्रतिशत संवर्धन (एमपीई) के रूप मा व्यक्त कीन जात हैं, जइसे कि पहिले वर्णित कीन गा है (42)।
जमे हुए न्यूरॉन गोली का बर्फ-ठंडा 80% मेथनॉल (v/v) मा समरूप बनावा गा रहा, भंवर बनावा गा रहा, अऊर 30 मिनट के लिए -20°C पर ऊष्मायन करा गा रहा। नमूना का फिर से भँवर करा अऊर 30 मिनट तक +4°C पर हिलावा। नमूना 4°C पर 5 मिनट के लिए 21,000 g पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा, अऊर फिर परिणामी सुपरनेटेंट का एकत्रित कीन गा रहा अऊर बाद के विश्लेषण के लिए 25°C पर एक स्पीडवैक सांद्रक का उपयोग कइके सुखावा गा रहा। जैसा कि ऊपर वर्णित है, क्रमबद्ध कोशिकाओं के अमीनो एसिड पर एलसी-एमएस विश्लेषण कीन गा रहा। ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करत हुए, डेटा विश्लेषण प्रत्येक यौगिक के मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान का उपयोग करत हुए कीन गा रहा। चयापचय डेटा का क्वांटाइल सामान्यीकरण प्रीप्रोसेसकोर सॉफ्टवेयर पैकेज (57) का उपयोग कइके कीन गा रहा।
टुकड़ा तैयारी। माउस का कार्बन डाइऑक्साइड से जल्दी से बेहोश कीन गा अऊर सिर काट दीन गा, दिमाग का खोपड़ी से जल्दी से हटावा गा, अऊर बर्फ से भरा कंपन चाकू (एचएम-650 वी, थर्मो फिशर साइंटिफिक, वालडोर्फ, जर्मनी) का उपयोग ओका 300 से 375 माइक्रोन धनुष खंडन मा काटै के लिए कीन गा (25% कार्बन गैसीकरण अऊर COd गैसीकरण (25%) कम सीए 2 + एसीएसएफ (125.0 एमएम एनएसीएल, 2.5 एमएम केसीएल, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 एमएम एनएएचसीओ 3, 25.0 एमएम डी-ग्लूकोज, 1.0 एमएम सीएसीएल 2 अऊर 6.0 एमएम एमजीसीएल 2 पीएच 37 अऊर 30 एमओ एमओ मा समायोजित करा)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस का एक कक्ष मा स्थानांतरित करा जेहिमा उच्च Ca2 + ACSF (125.0 एमएम NaCl, 2.5 एमएम KCl, 1.25 एमएम सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 एमएम NaHCO3, 25.0 एमएम डी-ग्लूकोज, 4.0 एमएम सीए2 एमएम सीए अऊर 5 एमएम पीएचसी 7.4 अऊर 310 से 320 एमओएसएम)। स्लाइस का 20 से 30 मिनट तक संग्रहीत करा ताकि रिकॉर्डिंग से पहिले ओनका बहाल कीन जा सके।
रिकॉर्डिंग। सब रिकॉर्डिंग के लिए एक निश्चित रिकॉर्डिंग चैम्बर अऊर 20x वाटर इमर्सन ऑब्जेक्टिव लेंस (साइंटिफिका) से सुसज्जित एक माइक्रोस्कोप स्टेज का उपयोग कीन गा रहा। पुटेटिव पुर्किंज कोशिका (i) शरीर के आकार, (ii) सेरिबैलम के शारीरिक स्थान अऊर (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीन के अभिव्यक्ति से पहचाना गा रहा। से 11 मेगोहम्स के टिप प्रतिरोध वाला पैच पिपेट का एक बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (जीबी150-10, 0.86 मिमी×1.5 मिमी×100 मिमी, साइंस प्रोडक्ट्स, होफहेम, जर्मनी) अऊर एक क्षैतिज पिपेट इंस्ट्रूमेंट्स (पी-1000, नोटोवा, सीए) द्वारा बाहर निकाला जात है। सब रिकॉर्डिंग ईएलसी-03एक्सएस एनपीआई पैच क्लैंप एम्पलीफायर (एनपीआई इलेक्ट्रॉनिक जीएमबीएच, टैम, जर्मनी) द्वारा कीन गै रही, जेका सॉफ्टवेयर सिग्नल (संस्करण 6.0, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा नियंत्रित कीन जात रहा। प्रयोग 12.5 किलोहर्ट्ज के नमूना दर से दर्ज कीन गा रहा। संकेत का क्रमशः 1.3 अऊर 10 किलोहर्ट्ज के कटऑफ आवृत्ति के साथ दुई शॉर्ट-पास बेसल फिल्टर से फ़िल्टर कीन जात है। झिल्ली अऊर पिपेट के समाई का एम्पलीफायर का उपयोग कइके मुआवजा सर्किट द्वारा मुआवजा दीन जात है। सब प्रयोग एक ऑर्का-फ्लैश 4.0 कैमरा (हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) के नियंत्रण मा कीन गा रहें, जेका होकावो सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.8, हमामात्सु, गेर्डेन, जर्मनी) द्वारा नियंत्रित कीन जात रहा।
नियमित पूरे-कोशिका विन्यास अऊर विश्लेषण। रिकॉर्डिंग से तुरंत पहिले, पिपेट का निम्नलिखित पदार्थन से युक्त आंतरिक घोल से भरौ: 4.0 एमएम केसीएल, 2.0 एमएम एनएसीएल, 0.2 एमएम ईजीटीए, 135.0 एमएम पोटेशियम ग्लूकोनेट, 10.0 एमएम हेपेस, 4.0 एमएम एटीपी (एमएम जी), 05 एमएम ट्राइफोनेट। (जीटीपी) (ना) अऊर 10.0 एमएम क्रिएटिनिन फॉस्फेट का पीएच 7.25 मा समायोजित कीन गा रहा, अऊर आसमाटिक दबाव 290 एमओएसएम (सुक्रोज) रहा। झिल्ली का फूटै के लिए 0 पीए का बल लगावै के तुरंत बाद, विश्राम झिल्ली विभव का मापा गा रहा। इनपुट प्रतिरोध -40, -30, -20 अऊर -10 पीए के हाइपरपोलराइज्ड करंट लगा के मापा जात है। वोल्टेज प्रतिक्रिया के परिमाण का मापौ अऊर इनपुट प्रतिरोध के गणना करै के लिए ओम के नियम का उपयोग करौ। सहज गतिविधि का 5 मिनट के लिए एक वोल्टेज क्लैंप मा दर्ज कीन गा रहा, अऊर एसपीएससी का एक अर्ध-स्वचालित पहचान स्क्रिप्ट का उपयोग कइके इगोर प्रो (संस्करण 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओसवेगो, ओरेगन, यूएसए) मा पहचाना अऊर मापा गा रहा। IV वक्र अऊर स्थिर-राज्य धारा का बैटरी का अलग-अलग विभव (-110 एमवी से शुरू) पर क्लैम्पिंग अऊर 5 एमवी चरणन मा वोल्टेज बढ़ावै से मापा जात है। एपी के उत्पादन का परीक्षण एक विध्रुवीकरण धारा लागू कइके कीन गा रहा। एक विध्रुवीकरण करंट पल्स लागू करत समय सेल का -70 एमवी पर क्लैम्प करा। हर रिकॉर्डिंग इकाई के चरण आकार का अलग-अलग (10 से 60 पीए) समायोजित करा। सबसे अधिक एपी आवृत्ति का कारण बनै वाले पल्स स्पाइक्स का मैन्युअल रूप से गिनकर अधिकतम एपी आवृत्ति के गणना करा। एपी थ्रेसहोल्ड का विश्लेषण विध्रुवीकरण पल्स के दूसर व्युत्पन्न का उपयोग कइके कीन जात है जवन पहिले एक या एक से अधिक एपी का ट्रिगर करत है।
छिद्रित पैच विन्यास अऊर विश्लेषण। मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कइके छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग करा। एक एटीपी- अऊर जीटीपी-मुक्त पिपेट का उपयोग करा जेहिमा निम्नलिखित अवयव न हो: 128 एमएम ग्लूकोनेट के, 10 एमएम केसीएल, 10 एमएम हेपेस, 0.1 एमएम ईजीटीए अऊर 2 एमएम एमजीसीएल 2, अऊर पीएच 7.2 (केओएच का उपयोग कइके) तक समायोजित करा। कोशिका झिल्ली के अनियंत्रित पारगम्यता का रोकै के लिए इंट्रासेल्युलर घोल से एटीपी अऊर जीटीपी का छोड़ दीन जात है। छिद्रित पैच का रिकॉर्ड प्राप्त करै के लिए पैच पिपेट का एक एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक घोल (लगभग 200 से 250 μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) से भरा जात है। एम्फोटेरिसिन का डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (अंतिम सांद्रता: 0.1 से 0.3%; डीएमएसओ; डी8418, सिग्मा-एल्ड्रिच) मा घुलावा गा रहा। उपयोग कीन गा डीएमएसओ के सांद्रता का अध्ययन कीन गा न्यूरॉन्स पर कौनो महत्वपूर्ण प्रभाव नाहीं पड़ा। पंचिंग प्रक्रिया के दौरान, चैनल प्रतिरोध (रा) का लगातार निगरानी कीन जात रहा, अऊर प्रयोग रा अऊर एपी के आयाम के स्थिर होए के बाद (20-40 मिनट) शुरू कीन जात रहा। सहज गतिविधि का 2 से 5 मिनट तक वोल्टेज अऊर/या करंट क्लैंप मा मापा जात है। डेटा विश्लेषण इगोर प्रो (संस्करण 7.05.2, वेवमेट्रिक्स, यूएसए), एक्सेल (संस्करण 2010, माइक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, यूएसए) अऊर ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 8.1.2, ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए) का उपयोग कइके कीन गा रहा। संयुक्त राज्य अमेरिका)। सहज एपी के पहचान करै के खातिर, इगोरप्रो के न्यूरोमैटिक v3.0c प्लग-इन का उपयोग कीन जात है। एक दिहल गै सीमा का उपयोग कइके स्वचालित रूप से एपी के पहचान करा, जेका हर रिकॉर्ड के लिए व्यक्तिगत रूप से समायोजित कीन जात है। स्पाइक अंतराल का उपयोग करत हुए, अधिकतम तात्कालिक स्पाइक आवृत्ति अऊर औसत स्पाइक आवृत्ति के साथ स्पाइक आवृत्ति का निर्धारित करा।
पीएन अलगाव। पहिले से प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुकूलित कइके, पीएन का एक निर्दिष्ट चरण (58) मा माउस सेरिबैलम से शुद्ध कीन गा रहा। संक्षेप मा, सेरिबैलम का विच्छेदन अऊर बर्फ-ठंडा विघटन माध्यम [एचबीएसएस सीए 2+ अऊर एमजी 2+ के बिना, 20 एमएम ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 यू/एमएल) अऊर स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 मिलीग्राम/एमएल) के साथ पूरक] मा विच्छेदित कीन गा रहा, अऊर फिर माध्यम का पचावा गा रहा [एचबीएसएस, पेनिसिलिन (50 यू/एमएल) के साथ पूरक]. (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर), पपेन (16 यू / मिलीलीटर) अऊर डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिअस I (डीएनएज I; 0.1 मिलीग्राम/मिलीलीटर)] 30°C पर 30 मिनट तक इलाज करा। एंजाइमी पाचन का रोकै के लिए कमरा के तापमान पर अंडा श्लेष्म (10 मिलीग्राम/एमएल), बीएसए (10 मिलीग्राम/एमएल) अऊर डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) युक्त एचबीएसएस माध्यम मा ऊतकन का धोवा जाय, अऊर फिर एचबीएसएस माध्यम मा 20 एमएम ग्लूकोज युक्त एचबीएसएस माध्यम मा धीरे-धीरे पीस के एचबीएसएस पेलिनिक, स्ट्रीपिन (यूएसपीएल) (0.05 मिलीग्राम/मिलीलीटर) अऊर डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/मिलीलीटर) एकल कोशिका छोड़त हैं। परिणामी कोशिका निलंबन का 70μm कोशिका छलनी के माध्यम से फ़िल्टर कीन गा रहा, फिर कोशिका का सेंट्रीफ्यूजेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा गोली बनावा गा रहा अऊर सॉर्टिंग माध्यम [एचबीएसएस, 20 एमएम ग्लूकोज, 20% भ्रूण गोजातीय के साथ पूरक) सीरम, पेलिनिक (500) अऊर स्ट्रेपिनिक स्ट्रेपिनिक मा पुन: निलंबित कीन गा रहा। (0.05 मिलीग्राम/मिलीलीटर)]; प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ कोशिका व्यवहार्यता का मूल्यांकन करा अऊर कोशिका घनत्व का 1×106 से 2×106 कोशिका/एमएल तक समायोजित करा। प्रवाह साइटोमेट्री से पहिले, निलंबन का 50 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से फ़िल्टर कीन गा रहा।
फ्लो साइटोमीटर। सेल सॉर्टिंग 4°C पर FACSAria III मशीन (बीडी बायोसाइंसेज) अऊर FACSDiva सॉफ्टवेयर (बीडी बायोसाइंसेज, संस्करण 8.0.1) का उपयोग कइके कीन गा रहा। कोशिका निलंबन का ~2800 घटना/सेकंड के दर से 20 पीएसआई के दबाव मा 100 माइक्रोन नोजल का उपयोग कइके छाँटा गा रहा। चूंकि पारंपरिक गेटिंग मानदंड (कोशिका आकार, द्विपद भेदभाव अऊर प्रकीर्णन विशेषता) अन्य कोशिका प्रकारन से पीएन के सही अलगाव सुनिश्चित नाहीं कइ सकत हैं, एहसे गेटिंग रणनीति mitoYFP+ ​​अऊर नियंत्रण mitoYFP − चूहों मा YFP तीव्रता अऊर ऑटोफ्लोरोसेंस के सीधी तुलना के आधार पर सेट कीन जात है। वाईएफपी का 488 एनएम लेजर लाइन से नमूना विकिरणित कइके उत्तेजित कीन जात है, अऊर 530/30 एनएम बैंड पास फिल्टर का उपयोग कइके संकेत का पता लगावा जात है। mitoYFP+ ​​चूहों मा, Rosa26-mitoYFP रिपोर्टर जीन के सापेक्ष ताकत का उपयोग तंत्रिका शरीर अऊर अक्षतंतु टुकड़न का अलग करै के लिए भी कीन जात है। 7-एएडी 561 एनएम पीले लेजर से उत्तेजित होत है अऊर मृत कोशिका का बाहर करै के लिए 675/20 एनएम बैंडपास फिल्टर से पता लगावा जात है। एक साथ एस्ट्रोसाइट्स का अलग करै के खातिर, कोशिका निलंबन का एसीएसए-2-एपीसी से दाग दीन गा रहा, फिर नमूना का 640 एनएम लेजर लाइन से विकिरणित कीन गा रहा, अऊर संकेत का पता लगावै के लिए 660/20 एनएम बैंडपास फिल्टर का उपयोग कीन गा रहा।
एकत्रित कोशिका का अपकेंद्रण (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा गोली बनावा गा रहा अऊर उपयोग तक -80°C पर संग्रहीत कीन गा रहा। प्रक्रियात्मक परिवर्तनशीलता का कम करै के लिए Mfn2cKO चूहों अऊर ओनके कूड़े के पिल्लन का एकै दिन वर्गीकृत कीन जात है। एफएसीएस डेटा प्रस्तुति अऊर विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशलैंड, ओरेगन, यूएसए) का उपयोग कइके कीन गा रहा।
जैसा कि ऊपर बतावा गा है (59), बाद के एमटीडीएनए माप के लिए क्रमबद्ध न्यूरॉन्स से डीएनए का अलग करै के लिए वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कीन जात है। रैखिकता अऊर थ्रेसहोल्ड संवेदनशीलता का शुरू मा अलग-अलग संख्या मा कोशिका पर qPCR चला के परीक्षण कीन गा रहा। संक्षेप मा, 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.5), 1 एमएम ईडीटीए, 0.5% ट्वीन 20 अऊर प्रोटीनेज के (200 एनजी/एमएल) से मिलके एक लाइसिस बफर मा 300 पीएन एकत्र करा अऊर 55°C 120 मिनट पर ऊष्मायन करा। कोशिकाओं का आगे 95°C पर 10 मिनट के लिए ऊष्मायन करा गा रहा ताकि प्रोटीनेज के के पूर्ण निष्क्रियता सुनिश्चित कीन जा सके। एमटी-एनडी 1 के लिए विशिष्ट एक टैकमैन जांच (थर्मो फिशर) का उपयोग करत हुए, एमटीडीएनए का 7900एचटी रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मोरफिक साइंटिफिक) मा अर्ध-मात्रात्मक पीसीआर द्वारा मापा गा रहा। विज्ञान, कैटलॉग नंबर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर AIVI3E8) अऊर 18S (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Hs99999901_s1) जीन।
प्रोटिओम नमूना तैयारी। मिनट के लिए 95°C पर घोल का गरम कइके अऊर लाइसिस बफर [6 एम ग्वानिडिन क्लोराइड, 10 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 10 एमएम क्लोरोएसीटामाइड अऊर 100 एमएम ट्रिस-लाइसिस फ्रोजन न्यूरॉन पेलेट्स इन एचसी] मा सोनिकेट कइके। बायोरप्टर (डायजेनोड) पर 10 मिनट (30 सेकंड पल्स / 30 सेकंड विराम अवधि) के लिए। नमूना का 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) मा 1:10 पतला कीन गा रहा, 300 एनजी ट्रिप्सिन गोल्ड (प्रोमेगा) के साथ मिलावा गा रहा, अऊर पूरा पाचन प्राप्त करै के लिए 37°C पर रात भर ऊष्मायन करा गा रहा। दूसर दिन, नमूना 20 मिनट के लिए 20,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कीन गा रहा। सुपरनेटेंट का 0.1% फार्मिक एसिड से पतला कीन गा रहा, अऊर घोल का स्व-निर्मित स्टेजटिप्स से नमकीन बनावा गा रहा। नमूना का 45°C पर एक स्पीडवैक उपकरण (एपेंडॉर्फ सांद्रक प्लस 5305) मा सुखावा गा रहा, अऊर फिर पेप्टाइड का 0.1% फार्मिक एसिड मा निलंबित करा गा रहा। सब नमूना एकै साथ एकै मनई द्वारा तैयार कीन गा रहा। एस्ट्रोसाइट नमूनों का विश्लेषण करै के लिए, 4 μg डीसाल्टेड पेप्टाइड्स का एक टैंडेम मास टैग (टीएमटी10प्लेक्स, कैटलॉग नंबर 90110, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ 1:20 के पेप्टाइड से टीएमटी अभिकर्मक अनुपात के साथ लेबल कीन गा रहा। टीएमटी लेबलिंग के लिए, टीएमटी अभिकर्मक के 0.8 मिलीग्राम का 70 μl निर्जल एसीएन मा फिर से निलंबित कीन गा रहा, अऊर सूखे पेप्टाइड का 0.1 एम टीईएबी (ट्राइएथिलैमोनियम बाइकार्बोनेट) के 9 μl मा पुनर्गठित कीन गा रहा, जेहिमा एसीएन मा टीएमटी अभिकर्मक के 7 μl जोड़ा गा रहा। एकाग्रता 43.75% रही। ऊष्मायन के 60 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया का 5% हाइड्रोक्सीलामाइन के 2 μl से बुझावा गा रहा। लेबल कीन गा पेप्टाइड एकत्र कीन गा, सुखावा गा, 0.1% फार्मिक एसिड (एफए) के 200 μl मा फिर से निलंबित कीन गा, दुई भागन मा विभाजित कीन गा, अऊर फिर स्व-निर्मित स्टेजटिप्स का उपयोग कइके नमक मुक्त कीन गा। अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ) का उपयोग करत हुए, दुइनौ आधे मा से एक का 130Å1.7μm C18 कणन से भरे 1 मिमी x 150 मिमी एक्विटी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम पर विभाजित कीन गा रहा (वाटर्स, कैटलॉग नंबर एसकेयू: 1985665)। थर्मो फिशर साइंटिफिक)। पेप्टाइड्स का 30 μl/min के प्रवाह दर से अलग करा, 96 मिनट के चरणबद्ध ढाल के साथ 85 मिनट के लिए 1% से 50% बफर बी का अलग करा, 3 मिनट के लिए 50% से 95% बफर बी तक, फिर 95 % बफर बी के लिए 8 मिनट; बफर ए 5% एसीएन अऊर 10 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) है, अऊर बफर बी 80% एसीएन अऊर 10 एमएम एबीसी है। हर 3 मिनट मा अंश एकत्र करा अऊर ओनका दुई समूहन (1 + 17, 2 + 18, आदि) मा मिलावा अऊर ओनका वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज मा सुखावा।
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए, पेप्टाइड्स (संख्या r119.aq) का 25 सेमी, 75 माइक्रोन आंतरिक व्यास वाले पिकोफ्रिट विश्लेषणात्मक स्तंभ (नया उद्देश्य लेंस, भाग संख्या PF7508250) पर अलग कीन गा रहा जवन 1.9 माइक्रोन ReproSil-Pur 120 C18-AQD माध्यम (Maisch-AQD) से सुसज्जित रहा, Maischr-Y.S. 1200 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, जर्मनी)। स्तंभ का 50°C पर बनाए रखा गा रहा। बफर ए अऊर बी क्रमशः पानी मा 0.1% फार्मिक एसिड अऊर 80% एसीएन मा 0.1% फार्मिक एसिड हैं। पेप्टाइड्स का 65 मिनट के लिए 6% से 31% बफर बी अऊर 5 मिनट के लिए 31% से 50% बफर बी तक 200 एनएल/मिनट के चरणबद्ध ढाल के साथ अलग कीन गा रहा। एल्यूटेड पेप्टाइड्स का एक ऑर्बिट्रैप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर विश्लेषण कीन गा रहा। पेप्टाइड अग्रदूत m/z माप 350 से 1500 m/z के सीमा मा 120,000 के रिज़ॉल्यूशन के साथ कीन जात है। 27% सामान्यीकृत टकराव ऊर्जा का उपयोग करत हुए, 2 से 6 के आवेश अवस्था के साथ सबसे मजबूत अग्रदूत का चयन उच्च ऊर्जा सी ट्रैप डिसोसिएशन (एचसीडी) क्लीवेज के लिए कीन जात है। चक्र समय 1 सेकंड पर सेट कीन गा है। पेप्टाइड टुकड़ा के एम/जेड मान का आयन जाल मा 5×104 के सबसे छोट एजीसी लक्ष्य अऊर 86 एमएस के अधिकतम इंजेक्शन समय का उपयोग कइके मापा गा रहा। विखंडन के बाद, अग्रदूत का 45 सेकंड के लिए गतिशील बहिष्कार सूची मा रखा गा रहा। टीएमटी-लेबल पेप्टाइड्स का 50 सेमी, 75 माइक्रोन एक्लेम पेपमैप कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर 164942) पर अलग कीन गा रहा, अऊर प्रवासन स्पेक्ट्रा का एक ऑर्बिट्रैप लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर विश्लेषण कीन गा रहा जवन उच्च-सममित तरंग तरंग (आईएमएसआईएमएस) से सुसज्जित रहा। उपकरण (थर्मो फिशर साइंटिफिक) −50 अऊर −70 V के दुई मुआवजा वोल्टेज पर काम करत है। तुल्यकालन अग्रदूत के आधार पर चुना गा एमएस 3 का उपयोग टीएमटी रिपोर्ट आयन संकेत माप के लिए कीन जात है। पेप्टाइड पृथक्करण EASY-nLC 1200 पर 90% रैखिक ढाल इल्यूशन का उपयोग करत हुए, 6% से 31% के बफर सांद्रता के साथ कीन गा रहा; बफर ए 0.1% एफए रहा, अऊर बफर बी 0.1% एफए अऊर 80% एसीएन रहा। विश्लेषणात्मक स्तंभ 50°C पर संचालित कीन जात है। FAIMS मुआवजा वोल्टेज के अनुसार मूल फ़ाइल का विभाजित करै के लिए फ्रीस्टाइल (संस्करण 1.6, थर्मो फिशर साइंटिफिक) का उपयोग करा।
प्रोटीन पहचान अऊर मात्रा निर्धारण। एकीकृत एंड्रोमेडा खोज इंजन का उपयोग करत हुए, मूल डेटा का विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) का उपयोग कइके कीन गा रहा। एकोरिया विक्टोरिया से प्राप्त क्रे रीकॉम्बिनेज अऊर वाईएफपी अनुक्रमन के अलावा, पेप्टाइड टुकड़ा स्पेक्ट्रा का माउस संदर्भ प्रोटीओम (प्रोटीओम आईडी यूपी000000589, मई 2017 मा यूनिप्रोट से डाउनलोड कीन गा) के विहित अनुक्रम अऊर आइसोफॉर्म अनुक्रम के लिए खोजा गा रहा। मेथियोनिन ऑक्सीकरण अऊर प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशन का चर संशोधन के रूप मा सेट कीन गा रहा; सिस्टीन कार्बामोइल मिथाइलेशन का निश्चित संशोधन के रूप मा सेट कीन गा रहा। पाचन पैरामीटर "विशिष्टता" अऊर "ट्रिप्सिन/पी" पर सेट कीन जात हैं। प्रोटीन पहचान के लिए उपयोग कीन जाय वाले पेप्टाइड अऊर रेजर पेप्टाइड के न्यूनतम संख्या 1 है; अद्वितीय पेप्टाइडन के न्यूनतम संख्या 0 है। पेप्टाइड मैप मिलान के परिस्थितियन मा, प्रोटीन पहचान दर 0.01 रही। "दूसरा पेप्टाइड" विकल्प सक्षम है। अलग-अलग मूल फाइलन के बीच सफल पहचान स्थानांतरित करै के लिए "रन के बीच मिलान" विकल्प का उपयोग करा। लेबल-मुक्त मात्रा (एलएफक्यू) (60) के लिए एलएफक्यू न्यूनतम अनुपात गिनती 1 का उपयोग करा। एलएफक्यू तीव्रता का हर समय बिंदु पर कम से कम एक जीनोटाइप समूह मा कम से कम दुई वैध मानन के लिए फ़िल्टर कीन जात है, अऊर चौड़ाई के साथ एक सामान्य वितरण से बाहर निकाला जात है। 0.3 अऊर 1.8 नीचे चलौ। एलएफक्यू परिणामन का विश्लेषण करै के लिए पर्सियस कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) अऊर आर (https://r-project.org/) का उपयोग करा। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण (61) के लिए लिम्मा सॉफ्टवेयर पैकेज से एक दु-तरफा मध्यम टी परीक्षण का उपयोग कीन गा रहा। खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally अऊर pheatmap का उपयोग कइके कीन जात है। टीएमटी-आधारित प्रोटिओमिक्स डेटा का मैक्सक्वांट संस्करण 1.6.10.43 का उपयोग कइके विश्लेषण कीन गा रहा। यूनिप्रोट के मानव प्रोटिओमिक्स डेटाबेस से कच्चे प्रोटिओमिक्स डेटा के खोज करा, जेका सितंबर 2018 मा डाउनलोड कीन गा रहा। विश्लेषण मा निर्माता द्वारा प्रदान कीन गा समस्थानिक शुद्धता सुधार कारक शामिल है। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए आर मा लिम्मा का उपयोग करा। मूल डेटा, डेटाबेस खोज परिणाम, अऊर डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह अऊर परिणाम सब डेटा सेट पहचानकर्ता PXD019690 के साथ PRIDE भागीदार भंडार के माध्यम से ProteomeXchange गठबंधन मा संग्रहीत कीन जात हैं।
कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण का समृद्ध करत हैं। सप्ताह (चित्र 1) मा डेटा सेट के कार्यात्मक एनोटेशन शब्दन के समृद्धि का निर्धारित करै के लिए इंजेन्यूटी पाथवे एनालिसिस (क्यूआईएजीईएन) उपकरण का उपयोग कीन गा रहा। संक्षेप मा, एलसी-एमएस/एमएस (टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा विश्लेषण से प्राप्त मात्रात्मक प्रोटीन सूची का उपयोग निम्नलिखित फिल्टर मानदंडन के साथ कीन जात है: मस मस्कुलस का प्रजाति अऊर पृष्ठभूमि के रूप मा चुना जात है, अऊर श्रेणी 0.05 या ओसे कम संवर्धन के लिए बेंजामिनी द्वारा समायोजित पी मान देखावत है जेका महत्वपूर्ण माना जात है। यहि ग्राफ के लिए, समायोजित पी मान के आधार पर प्रत्येक क्लस्टर मा शीर्ष पांच अतिरिक्त श्रेणियन का देखावा गा है। कई टी-टेस्ट का उपयोग करत हुए, बेंजामिनी, क्रीगर अऊर येकुटीएली (क्यू = 5%) के दुई-चरण रैखिक बूस्ट कार्यक्रम का उपयोग करत हुए, प्रत्येक श्रेणी मा पहचाने गए महत्वपूर्ण उम्मीदवारन पर समय-कोर्स प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण कीन जात है, अऊर प्रत्येक पंक्ति का अलग-अलग विश्लेषण कीन जात है। एक सुसंगत एसडी अपनावै के जरूरत नाहीं है।
प्रकाशित डेटाबेस के साथ यहि अध्ययन के परिणामन के तुलना करै अऊर चित्र 1 मा एक वेन आरेख उत्पन्न करै के खातिर, हम मात्रात्मक प्रोटीन सूची का माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन (24) के साथ जोड़िन। आरेख बनावै के लिए ऑनलाइन उपकरण ड्रा वेन आरेख (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) का उपयोग करा।
प्रोटिओमिक्स विश्लेषण के लिए उपयोग कीन जाय वाली सांख्यिकीय प्रक्रियाओं के बारे मा विस्तृत जानकारी के लिए, कृपया सामग्री अऊर विधियन के संबंधित खंड का देखौ। बाकी सब प्रयोगन के लिए, विस्तृत जानकारी संबंधित किंवदंती मा पाई जा सकत है। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट न कीन जाय, तब तक सब डेटा औसत ± SEM के रूप मा व्यक्त कीन जात है, अऊर सब सांख्यिकीय विश्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 8.1.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग कइके कीन गा रहा।
यहि लेख के लिए पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 देखौ
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ई. मोटोरी, आई. अटानासोव, एसएमवी कोचन, के. फोल्ज़-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलु, पी. गियावालिस्को, एन. टोनी, जे. पुयल, एन.-जी. लार्सन
अकार्यात्मक न्यूरॉन्स के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि चयापचय कार्यक्रम न्यूरोडिजनरेशन का मुकाबला करै के लिए सक्रिय होत हैं।
ई. मोटोरी, आई. अटानासोव, एसएमवी कोचन, के. फोल्ज़-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलु, पी. गियावालिस्को, एन. टोनी, जे. पुयल, एन.-जी. लार्सन
अकार्यात्मक न्यूरॉन्स के प्रोटिओमिक्स विश्लेषण से पता चला कि चयापचय कार्यक्रम न्यूरोडिजनरेशन का मुकाबला करै के लिए सक्रिय होत हैं।
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