वर्तमान†वर्तमान पता: OX11 0DE, यूके, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल साइंस एंड इनोवेशन पार्क, डाइटकोट, ऑक्सफोर्डशायर, यूके, डायमंड लाइट सोर्स कंपनी लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक बायोलॉजिकल इमेजिंग सेंटर।
प्रतिक्रिया केंद्र प्रकाश-कटाई परिसर 1 (आरसी-एलएच 1) बैंगनी फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया का मूल प्रकाश संश्लेषण घटक है। हम रोडोप्स्यूडोमोनास पैलुस्ट्रिस से आरसी-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स के दुई क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचना पेश किहिन। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के 2.65-Å रिज़ॉल्यूशन संरचना मा आरसी के चारों ओर 14 सबयूनिट एलएच1 लूप होत हैं, जेका प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा बाधित कीन जात है, जबकि प्रोटीन-डब्ल्यू के बिना कॉम्प्लेक्स पूरी तरह से आरसी से घिरा आरसी संरचना होत है। सबयूनिट एलएच 1 लूप बंद होइ गवा। इन संरचनाओं के तुलना आरसी-एलएच 1 परिसर मा क्विनोन के गतिशीलता मा अंतर्दृष्टि प्रदान करत है, जेहिमा आरसी क्यूबी साइट पर क्विनोन का बाइंडिंग करत समय पहिले से अनिर्धारित संरचनात्मक परिवर्तन शामिल हैं, साथ ही साथ सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइटन के स्थान, जवन ओनका आरसी मा पास करै मा मदद करत हैं। डब्ल्यू प्रोटीन के अनूठी संरचना एलएच 1 लूप के बंद होवे से रोकत है, जेहिसे क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय का तेज करै के लिए एक चैनल बनत है।
प्रकाश संश्लेषण द्वारा प्रदान कीन जाय वाली ऊर्जा पृथ्वी पै लगभग सब जीवन का बनाए रख सकत है, अऊर यहिमा सौर जैव प्रौद्योगिकी के बहुत संभावना है। वैश्विक प्रकाश संश्लेषण का बढ़ावा देत समय, बैंगनी फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया विभिन्न ऊर्जा मोड अऊर चयापचय क्षमता भी प्रदर्शित करत हैं। उ प्रकाश संश्लेषण से बच सकत हैं अऊर अंधेरे मा विषमपोषी बैक्टीरिया के रूप मा बढ़ सकत हैं, नाइट्रोजन अऊर कार्बन डाइऑक्साइड का ठीक कर सकत हैं, हाइड्रोजन का उत्पादन कर सकत हैं अऊर सुगंधित यौगिकन का नीचा दिखा सकत हैं (1-3)। इन प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा प्रदान करै के लिए, प्रकाश का जल्दी अऊर कुशलता से रासायनिक ऊर्जा मा बदलै का चाही। ई प्रक्रिया तब शुरू होत है जब प्रकाश-फंसावै वाला एंटीना परिसर प्रकाश का अवशोषित करत है अऊर फंसे ऊर्जा का प्रतिक्रिया केंद्र (आरसी) मा स्थानांतरित करत है, जेहिसे आवेश पृथक्करण (4 – 7) शुरू होत है। बैंगनी फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया मा प्रकाश संश्लेषण कय मूल इकाई टाइप 2 आरसी से बनी होत है, जवन प्रकाश-कटाई परिसर 1 (एलएच 1) से घिरा होत है, जवन आरसी-एलएच 1 कोर परिसर बनावत है। एलएच 1 घुमावदार αβ हेटरोडाइमर्स के एक सरणी से बनत है, जेहिमा से हर एक दुई जीवाणु क्लोरोफिल (बीसीएचएल) एक अणु अऊर एक या दुई कैरोटीनॉयड (8-12) का बाँधत है। सबसे सरल एलएच 1 एंटीना मा 16 या 17 αβ हेटरोडाइमर होत हैं जवन एक बंद लूप मा आरसी (9-13) का घेरत हैं, लेकिन अन्य कोर कॉम्प्लेक्स मा, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड्स आसपास के एलएच 1 के निरंतरता का बाधित करत हैं, जेहिसे आरसी अऊर साइटोक्रोम बीसी कॉम्प्लेक्स (1111, 13) के बीच क्विनोल / क्विनोन प्रसार का बढ़ावा मिलत है। बैंगनी फोटोट्रॉफिक पौधा रोडोप्स्यूडोमोनास (आरपीएस) एक मॉडल जीव है जवन ऊर्जा अऊर इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण का समझ सकत है जवन प्रकाश संश्लेषण का समर्थन करत है। आरपीएस का पहिला क्रिस्टल संरचना। पलुस्ट्रिस आरसी-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स का मॉडल आरसी है, जे 15 हेटरोडाइमेरिक एलएच 1 लूप से घिरा अहै, जेका "प्रोटीन डब्ल्यू" (14) नामक एक अज्ञात प्रोटीन द्वारा बाधित कीन जात है। प्रोटीन-डब्ल्यू का बाद मा आरपीए4402 के रूप मा पहचाना गा रहा, जवन तीन अनुमानित ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (टीएमएच) (16) के साथ एक अविशिष्ट 10.5 केडीए प्रोटीन है। हम rpa4402 जीन एन्कोडिंग प्रोटीन W का pufW मा बदलै का प्रस्ताव देत हैं ताकि RC-L, M (pufL, pufM) अऊर LH1α, β (pufA, pufB) सबयूनिट एन्कोडिंग जीन के लिए उपयोग कीन जाय वाली नामकरण के अनुरूप हो। दिलचस्प बात ई है कि प्रोटीन-डब्ल्यू केवल आरसी-एलएच 1 के लगभग 10% मा मौजूद है, जेसे आरपीएस का पता चलत है। पलुस्ट्रिस दुई अलग-अलग आरसी-एलएच 1 परिसर पैदा करत है। हिंया, हम दुई कोर कॉम्प्लेक्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम (क्रायो-ईएम) संरचनाओं के रिपोर्ट करत हैं, एक प्रोटीन डब्ल्यू अऊर 14 αβ हेटरोडाइमर के साथ, दूसर प्रोटीन डब्ल्यू के बिना अऊर एक बंद 16 हेटरोडाइमर एलएच 1 लूप के साथ। हमार संरचना आरपीएस के आरसी-एलएच 1 परिसर के समझ मा एक चरण परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करत है। palustris, काहे से कि हम हर संस्करण के सजातीय आबादी का विश्लेषण किहिन हैं अऊर हर पेप्टाइड अऊर बाध्य वर्णक अऊर संबंधित लिपिड अऊर क्विनोन का स्पष्ट रूप से असाइन करै के लिए पर्याप्त संकल्प है। इन संरचनाओं के तुलना से पता चलत है कि तीन टीएमएच प्रोटीन-डब्ल्यू जवन अब तक कौनो अन्य आरसी-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स मा नाहीं पाए गए हैं, क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय का तेज करै के लिए एक क्विनोन चैनल उत्पन्न करत हैं। कईयो संरक्षित लिपिड अऊर क्विनोन बाइंडिंग साइटन के पहचान कीन गै है, अऊर हमने क्विनोन अऊर आरसी के संयोजन के बाद एक नया संरचनात्मक परिवर्तन का पता लगावा है, जवन ऑक्सीजन युक्त फोटोट्रॉफिक जीवन के फोटोसिस्टम II (पीएसआईआई) आरसी के लिए उपयुक्त हो सकत है। हमार निष्कर्ष बैंगनी फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया के आरसी-एलएच 1 कोर कॉम्प्लेक्स मा क्विनोन/क्विनोलोन बाइंडिंग अऊर एक्सचेंज के गतिकी मा नई अंतर्दृष्टि प्रदान करत हैं।
आरपीएस मा पाए जाने वाले दुइनौ परिसरन के विस्तृत अध्ययन के सुविधा प्रदान करै के खातिर। palustris, हम जैव रासायनिक विधियन से प्रत्येक आरसी-एलएच 1 का अलग करत हैं। प्रोटीन डब्ल्यू-कमी परिसर (यहिके बाद ΔpufW के रूप मा संदर्भित) pufW जीन (16) के कमी वाले तनाव से शुद्ध कीन गा रहा, अऊर केवल एक RC-LH1 परिसर का उत्पादन कीन जा सकत है। प्रोटीन डब्ल्यू-युक्त कॉम्प्लेक्स एक तनाव द्वारा बनावा जात है। यहि तनाव के प्रोटीन डब्ल्यू का अपने सी-टर्मिनस पर 10x हिज टैग के साथ संशोधित कीन जात है, ताकि प्रोटीन डब्ल्यू युक्त कॉम्प्लेक्स का धातु का स्थिर कइके सबसे कमी वाले प्रोटीन डब्ल्यू के साथ प्रभावी ढंग से जोड़ा जा सके। परिसर का प्रभावी ढंग से अलग कीन जात है (16) आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी)।
जैसा कि चित्र 1 मा देखा गा है, दुइनौ परिसरन मा एक एलएच 1 एंटीना से घिरा तीन उप-इकाई आरसी (आरसी-एल, आरसी-एम अऊर आरसी-एच) होत है। प्रोटीन-डब्ल्यू के कमी वाले परिसर के 2.80-ए संरचना 16 αβ हेटरोडाइमर्स देखावत है, जवन आरसी के चारों ओर पूरी तरह से एक बंद एलएच 1 लूप बनावत है, जेका आगे आरसी-एलएच 116 परिसर के रूप मा संदर्भित कीन जात है। प्रोटीन-डब्ल्यू-युक्त परिसर के 2.65Å संरचना मा प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा बाधित 14-हेटरोडाइमर एलएच 1 होत है, जेका आगे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के रूप मा संदर्भित कीन जात है।
(ए अऊर बी) यौगिक का सतह प्रतिनिधित्व। (सी अऊर डी) छड़ मा व्यक्त बंधित वर्णक। (ई अऊर एफ) कोशिका द्रव्य सतह से देखे गए परिसरन मा कार्टून मा दर्शाए गए पेप्टाइड अऊर एलएच 1 सबयूनिट होत हैं, अऊर प्रोटीन-डब्ल्यू गैप से घड़ी के दिशा मा क्रमांकित होत हैं [आरबीए संख्या के अनुरूप। स्फेरोइड्स कॉम्प्लेक्स (13)]। LH1-α के लिए, प्रोटीन सबयूनिट का रंग पीला है; LH1-β के लिए, प्रोटीन सबयूनिट का रंग नीला है; प्रोटीन-डब्ल्यू के लिए, प्रोटीन लाल होत है; आरसी-एच के लिए, ई सियान है; आरसी-एल के लिए, ई नारंगी है; आरसी-एम के लिए, मैजेंटा। सहकारक छड़ द्वारा दर्शाए जात हैं, हरा BChl अऊर BPh a अणुओं का दर्शाता है, बैंगनी कैरोटीनॉइड्स का दर्शाता है, अऊर पीला UQ10 अणुओं का दर्शाता है। (जी अऊर एच) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स (जी) अऊर आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स (एच) के समकक्ष क्षेत्र मा प्रोटीन-डब्ल्यू गैप का आवर्धित दृश्य। सहकारक अंतरिक्ष भराव के रूप मा प्रदर्शित कीन जात हैं, चीलेटेड क्विनोन नीले रंग मा प्रदर्शित कीन जात है। प्रोटीन-डब्ल्यू गैप (जी) मा एक नीली धराशायी रेखा से उजागर कीन गा है, अऊर छोट छेद जहां क्विनोन/क्विनोलोल एलएच 116 रिंग पर फैलत है, (एच) मा एक काली धराशायी रेखा से उजागर कीन गा है।
चित्र 1 (ए अऊर बी) एलएच 1αβ हेटरोडाइमर्स के खुले या बंद सरणी से घिरा आरसी देखावत है, जेहिमा से हर एक दुई बीसीएचएल अऊर एक कैरोटीनॉइड (चित्र 1, सी अऊर डी) से बंधत है। पिछले अध्ययनन से पता चला है कि आरपीएस एलएच 1 कॉम्प्लेक्स है। स्पिरुलिना ज़ैंथिन के जैव संश्लेषण मार्ग मा, इन प्रजातियन मा कैरोटीनॉयड्स (17) के मिश्रित आबादी होत है। हालांकि, स्पाइरोपाइरोक्सैन्थिन प्रमुख कैरोटीनॉयड है अऊर एकर घनत्व संतोषजनक है। यहिसे, हम सब एलएच 1 बाइंडिंग साइटन पर स्पाइरोक्सैन्थिन का मॉडल करै का चुनेन। अल्फा अऊर बीटा पॉलीपेप्टाइड छोट झिल्ली बाहरी क्षेत्रन के साथ एकल टीएमएच हैं (चित्र 1, ए, बी, ई अऊर एफ)। यद्यपि सी-टर्मिनस पर 17 अवशेषन के घनत्व नाहीं देखल गै रहा, अल्फा पॉलीपेप्टाइड का दुइनौ परिसरन मा Met1 से Ala46 तक विभाजित कीन गा रहा। β पॉलीपेप्टाइड का आरसी-एलएच116 मा Gly4 से Tyr52 अऊर RC-LH114-W मा Ser5 से Tyr52 तक कम कीन गा रहा। या 4 एन-टर्मिनल या 13 सी-टर्मिनल अवशेषन का कौनो घनत्व नाहीं देखा गा रहा (चित्र एस 1)। जंगली-प्रकार के तनाव से तैयार मिश्रित आरसी-एलएच 1 परिसर के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पता चला कि लापता क्षेत्र इन पेप्टाइड्स के विषम दरार का परिणाम रहा (चित्र एस 1 अऊर एस 2)। α-Met1 का एन-टर्मिनल फॉर्मिलेशन भी देखल गै रहा (एफ)। विश्लेषण से पता चला कि α-पेप्टाइड मा fMet1 से Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 तक के अवशेष होत हैं, अऊर β-पेप्टाइड मा Ser2 से Ala53 तक के अवशेष होत हैं, जवन कम तापमान वाले ईएम घनत्व मानचित्र के साथ अच्छा समझौता करत है।
α-His29 अऊर β-His36 का समन्वय BChls का आमने-सामने बनावत है; हर αβ हेटरोडाइमर अपने पड़ोसियन के साथे इकट्ठा होइके आरसी के चारों ओर एक खुला लूप (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू) या एक बंद लूप (आरसी-एलएच116) बनावत है उत्तेजक युग्मित वर्णक सरणी (चित्र 1, सी अऊर डी)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के 877 एनएम बैंड के तुलना मा, आरसी-एलएच116 के 880 एनएम अवशोषण लाल पारी 3 एनएम है (चित्र 2 ए)। हालांकि, परिपत्र द्विगुणित स्पेक्ट्रम लगभग एकै है (चित्र 2 बी), ई दर्शाता है कि यद्यपि खुले अऊर बंद लूप के बीच एक स्पष्ट अंतर है, बीसीएचएल का स्थानीय वातावरण बहुत समान है। अवशोषण रेडशिफ्ट बंद लूप (18, 19) पर कम थर्मल गति अऊर बढ़ी हुई स्थिरता, बंद लूप (20, 21) के कारण वर्णक युग्मन में परिवर्तन, या इन दुइनौ प्रभावन का संयोजन (11) का परिणाम हो सकत है।
(ए) पराबैंगनी/दृश्यमान/निकट-अवरक्त अवशोषण स्पेक्ट्रम, जेकर चोटी उनके संबंधित वर्णक के साथ चिह्नित कीन जात हैं अऊर 775 एनएम पर बीपीएच चोटी के लिए सामान्यीकृत कीन जात हैं। (बी) 805 एनएम पर बीसीएचएल अवशोषण के लिए सामान्यीकृत परिपत्र द्विगुणित स्पेक्ट्रम। (सी अऊर डी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स (सी) अऊर आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स (डी) के समय-समाधान अवशोषण स्पेक्ट्रा से चयनित ΔA स्पेक्ट्रा। बेहतर तुलनीयता के लिए, सब स्पेक्ट्रा का 0.2 पीएस पर −A के ∆A तक सामान्यीकृत कीन जात है। (ई) यूक्यू 2 के विभिन्न सांद्रता के उपस्थिति मा विकिरण के बाद साइटोक्रोम सी 2 ऑक्सीकरण के दर (कच्चे डेटा के लिए चित्र एस 8 देखौ)। (एफ) कम, मध्यम या उच्च तीव्रता वाले प्रकाश (क्रमशः 10, 30 या 300μMm-2 s-1) के तहत उगाई गई कोशिकाओं में, शुद्ध परिसर में प्रोटीन डब्ल्यू अऊर आरसी-एल सबयूनिट अऊर अलग झिल्ली अनुपात। एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन अऊर इम्यूनोएसे द्वारा प्रोटीन स्तर का निर्धारित करा (कच्चे डेटा के लिए चित्र एस 9 देखौ)। शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के सापेक्ष अनुपात निर्धारित करा। परिसर के आरसी-एल से प्रोटीन-डब्ल्यू का स्टोइकोमेट्रिक अनुपात 1:1 है।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (चित्र 1, ए, सी अऊर ई) के विकृत αβ14 लूप मा स्थिति 1 पर बीसीएचएल आरसी-एलएच116 (चित्र 1, बी, डी, अऊर एफ, अऊर एस3) मा समकक्ष बीसीएचएल के तुलना मा आरसी प्राथमिक दाता (पी) के 6.8Å के करीब हैं; हालांकि, दुइनौ परिसरन के क्षणिक अवशोषण गतिकी से पता चलत है कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू अऊर आरसी-एलएच116 के लिए, एलएच1 से आरसी तक उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण समय स्थिरांक 40 ± 4 अऊर 44 ± 3 पीएस हैं (चित्र 2)। , सी अऊर डी, चित्र एस 4 अऊर तालिका एस 2)। आरसी (चित्र एस 5 अऊर संबंधित पूरक पाठ) के भीतर इलेक्ट्रॉनिक हस्तांतरण मा भी कौनो महत्वपूर्ण अंतर नाहीं है। हमका संदेह है कि एलएच 1 अऊर आरसी-पी के बीच ऊर्जा हस्तांतरण समय का निकट पत्राचार दुइनौ एलएच 1 लूप मा अधिकांश बीसीएचएल के समान दूरी, कोण अऊर संभावित ऊर्जा के कारण है। अइसा लागत है कि न्यूनतम दूरी तक पहुँचै के लिए एलएच 1 ऊर्जा पैटर्न का पता लगावै उप-इष्टतम साइटन से आरसी तक सीधे ऊर्जा हस्तांतरण से तेज नाहीं है। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा ओपन-लूप एलएच1 लूप संरचनात्मक विश्लेषण के लिए कम तापमान के स्थिति मा महत्वहीन थर्मल गति से भी गुजर सकत है, अऊर आरसी 1 के स्थिति मा βबीसीएचएल के रंजकता दूरी से कमरा के तापमान पर एक लंबा αβ14 रिंग संरचना है।
आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स मा 32 बीसीएचएल अऊर 16 कैरोटीनॉयड होत हैं, अऊर एकर समग्र व्यवस्था थर्मोक्रोमैटियम (टीएच.) पिडपिडम [प्रोटीन डेटा बैंक (पीडीबी) आईडी 5वाई5एस] (9), थियोरोडोविब्रियो (टीआरवी.) डीबी स्ट्रेन (डीबी077) स्ट्रेन (डीबी07) (297)) से प्राप्त व्यवस्था के समान है। अऊर हरियर शैवाल (बीएलसी.विरिडिस) (पीडीबी आईडी 6ईटी5) (10)। संरेखण के बाद, αβ हेटरोडाइमर्स के स्थिति मा केवल छोट विचलन देखे गए, खासकर 1-5, 15 अऊर 16 (चित्र S6)। प्रोटीन-डब्ल्यू के उपस्थिति से एलएच 1 के संरचना पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़त है। एकर तीन टीएमएच छोट लूप से जुड़े अहैं, जेहिमा कॉम्प्लेक्स के लुमेन साइड मा एन-टर्मिनल अऊर कोशिका द्रव्य साइड मा सी-टर्मिनल अहै (चित्र 1 ए अऊर 3, ए से डी)। प्रोटीन-डब्ल्यू काफी हद तक हाइड्रोफोबिक है (चित्र 3 बी), अऊर टीएमएच 2 अऊर टीएमएच 3 एक ट्रांसमेम्ब्रेन सतह बनावै के लिए एलएच 1αβ-14 के साथ बातचीत करत हैं (चित्र 3, बी अऊर ई से जी)। इंटरफ़ेस मुख्य रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र मा फे, ल्यू अऊर वैल अवशेषन से बना अहै। ई अवशेष हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड अऊर αβ-14 वर्णक के साथ ढेर होत हैं। कुछ ध्रुवीय अवशेष भी बातचीत मा योगदान देत हैं, जेहिमा जटिल गुहा के सतह पर W-Thr68 अऊर β-Trp42 के बीच हाइड्रोजन बंधन शामिल है (चित्र 3, एफ अऊर जी)। कोशिका द्रव्य के सतह पर, Gln34 αβ-14 कैरोटीनॉइड्स के कीटो समूह से सटे होत है। यहिके अलावा, एन-डोडेसिल β-डी-माल्टोसाइड (β-डीडीएम) अणु का हल कीन गा रहा, अऊर एकर हाइड्रोफोबिक पूंछ प्रोटीन-डब्ल्यू अऊर αβ-14 के बीच इंटरफेस तक फैली रही, अऊर लिपिड पूंछ शरीर मा स्थित होइ सकत है। हम इ भी देखेन कि प्रोटीन डब्ल्यू अऊर आरसीएच के सी-टर्मिनल रिज़ॉल्यूशन क्षेत्र बहुत करीब हैं, लेकिन विशिष्ट बातचीत बनावै के दायरे मा नाहीं हैं (चित्र 1, ए अऊर ई)। हालांकि, इन दुइनौ प्रोटीन के अनसुलझे सी-टर्मिनल अमीनो एसिड मा बातचीत होइ सकत है, जवन आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के संयोजन के दौरान प्रोटीन-डब्ल्यू के भर्ती के लिए एक तंत्र प्रदान कर सकत है।
(ए) प्रोटीन-डब्ल्यू, जवन कार्टून रूप मा LH1αβ14 के साथ इंटरफेस का सामना करत है, एक रॉड-आकार के साइड चेन (लाल) है, जवन इलेक्ट्रोस्टैटिक विभव आरेख (0.13 के समोच्च स्तर के साथ पारदर्शी ग्रे सतह) के एक हिस्सा मा प्रदर्शित कीन जात है। (बी) प्रोटीन-डब्ल्यू एक हाइड्रोफोबिक रंगीन सतह द्वारा दर्शाया जात है। ध्रुवीय अऊर आवेशित क्षेत्र सियान मा प्रदर्शित कीन जात हैं, हाइड्रोफोबिक क्षेत्र सफेद रंग मा प्रदर्शित कीन जात हैं, अऊर दृढ़ता से हाइड्रोफोबिक क्षेत्र नारंगी रंग मा प्रदर्शित कीन जात हैं। (सी अऊर डी) कार्टून मा दर्शाया गा प्रोटीन-डब्ल्यू, एकर अभिविन्यास (ए) (सी) के समान है, अऊर 180° (डी) से घुमावा गा है। अनुक्रम मा स्थिति के अनुसार, अलग-अलग अवशेष एक इंद्रधनुषी रंग योजना अपनावत हैं, जहां एन-टर्मिनल नीला अऊर सी-टर्मिनल लाल होत है। (ई) प्रोटीन-डब्ल्यू (ए) के समान दृश्य मा, अऊर प्रोटीन-डब्ल्यू: एलएच 1 के इंटरफेस पर अवशेष संलग्न चिह्नन के साथ छड़ द्वारा दर्शाए जात हैं। (F) कार्टून प्रतिनिधित्व मा (E) अऊर LH1αβ14 के सापेक्ष प्रोटीन-W 90° घुमावा जात है, अऊर बार प्रतिनिधित्व मा इंटरफेस अवशेषन के सापेक्ष। बीटा पॉलीपेप्टाइड से लटकत अवशेषन का लेबल कीन जात है। सहकारक का चित्र 1 के रंग से मेल खात एक पट्टी के रूप मा देखावा गा है, विघटित β-डीडीएम का ग्रे रंग मा देखावा गा है, अऊर ऑक्सीजन का लाल रंग मा देखावा गा है। (जी) (एफ) मा दृश्य 180° घुमावा गा है, जेहिमा लेबल किहे अल्फा पॉलीपेप्टाइड के प्रमुख अवशेष हैं।
प्रोटीन-डब्ल्यू एक αβ हेटरोडाइमर (चित्र 1F मा 15 वां) का बदल देत है, जेहिसे लूप बंद होवे से रोका जात है अऊर पहिले तीन αβ हेटरोडाइमर झुक जात हैं। ई देखल गै रहा कि फिल्म सामान्य के सापेक्ष पहिला αβ-1 हेटरोडाइमर का अधिकतम झुकाव कोण 25° से 29° (चित्र 1, ए अऊर ई) रहा, जवन आरसी ए शार्प कंट्रास्ट-एलएच116 (चित्र 1, बी अऊर एफ) मा αβ-1 के 2° से 8° झुकाव से बना रहा। दूसर अऊर तीसर हेटरोडाइमर क्रमशः 12° से 22° अऊर 5° से 10° तक झुके होत हैं। आरसी के स्टेरिक बाधा के कारण, αβ-1 के झुकाव मा αβ के दूसर जोड़ा शामिल नाहीं है (जवन चित्र 1F मा 16 वें αβ से मेल खात है), यहिसे LH1 रिंग (चित्र 1, ए अऊर ई) मा एक स्पष्ट अंतर बनत है। दुई αβ हेटरोडाइमर्स के कमी के कारण, चार बीसीएचएल अऊर दुई कैरोटीनॉइड्स के नुकसान के साथ, कैरोटीनॉइड्स में से कौनो भी मुड़ αβ-1 सबयूनिट से नहीं बंधत है, जेकरे परिणामस्वरूप एक एलएच114-डब्ल्यू रिंग बनत है जेहिमा 13 कैरोटीनॉइड्स शाकाहारी अऊर 28 बीसीएचएल होत हैं। αβ1 से 7 क्षेत्रन मा दुइनौ परिसरन के स्थानीय रिज़ॉल्यूशन अनुमान बाकी LH1 लूप के तुलना मा कम हैं, जवन आरसी क्यूबी साइट से सटे LH1 सबयूनिट के अंतर्निहित प्लास्टिसिटी का दर्शा सकत है (चित्र 4)।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए अऊर बी) अऊर आरसी-एलएच116 (सी अऊर डी) के चित्र एकै ऊपरी दृश्य/साइड व्यू (ए अऊर बी) (ए अऊर सी) अऊर चित्र 1 के गुहा सतह से देखावा गा है। (बी अऊर डी)। रंगीन कुंजी दाईं ओर दिखाई देत हैं।
1:14 के स्टोइकोमेट्रिक अनुपात वाला एकमात्र अन्य विशेषता कोर कॉम्प्लेक्स रोडोकोकस स्फेरोइड्स (आरबीए) आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर (13) है। हालांकि, प्रोटीन डब्ल्यू अऊर पफएक्स मा कौनो स्पष्ट समरूपता नाहीं है, अऊर ओनके संबंधित एलएच 1 संरचनाओं पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़त है। पफएक्स एक एन-टर्मिनल कोशिका द्रव्य डोमेन के साथ एक एकल टीएमएच है जो आरपीएस के अनुरूप एक स्थिति में आरसी-एच सबयूनिट (13) के कोशिका द्रव्य पक्ष के साथ बातचीत करत है। पलुस्ट्रिस एलएच116αβ-16। पफएक्स आरसी-एलएच 1 अऊर साइटोक्रोम बीसीएल कॉम्प्लेक्स के बीच क्विनोन/क्विनोलोन विनिमय के लिए एक चैनल बनावत है अऊर ई सब आरबीए मा मौजूद है। स्फेरोइड्स कोर कॉम्प्लेक्स (13) यद्यपि मोनोमर-मोनोमर इंटरफेस आरबीए मा है। स्फेरोइड्स आरसी-एलएच1-पफएक्स डाइमर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा प्रोटीन डब्ल्यू के बंधन स्थिति मा स्थित है, अऊर पफएक्स अऊर प्रोटीन-डब्ल्यू द्वारा प्रेरित अंतर एक समतुल्य स्थिति मा है (चित्र एस7ए)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा अंतर स्यूडोमोनास रोसिया एलएच1 के काल्पनिक क्विनोन चैनल (8) के साथ भी संरेखित है, जवन प्रोटीन डब्ल्यू या पफएक्स (चित्र एस7बी) से संबंधित न होय ​​वाले पेप्टाइड्स द्वारा बनत है। यहिके अलावा, बीएलसी मा क्विनोन चैनल। एक γ सबयूनिट (7) का बाहर कइके बनावा गा पन्ना हरा LH1 एक समान स्थिति मा स्थित है (चित्र S7C)। यद्यपि अलग-अलग प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता कीन जात है, आरसी-एलएच 1 परिसर मा एक सामान्य स्थिति मा इन क्विनोन / क्विनोलोल चैनलन के उपस्थिति अभिसरण विकास का एक उदाहरण प्रतीत होत है, जे बतावत है कि प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा बनावा गा अंतर क्विनोन चैनल के रूप मा काम कर सकत है।
LH114-W लूप मा अंतर RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स के आंतरिक स्थान अऊर थोक झिल्ली (चित्र 1G) के बीच एक निरंतर झिल्ली क्षेत्र के गठन के अनुमति देत है, बजाय प्रोटीन के तरह एक प्रोटीन छिद्र के माध्यम से दुइनौ डोमेन का जोड़े के। आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स एक बंद टीएच के समान है। सुई जइसन परिसर (22) (चित्र 1 एच)। चूंकि झिल्ली के माध्यम से क्विनोन का प्रसार संकीर्ण प्रोटीन चैनल के माध्यम से प्रसार से तेज है, खुला LH114-W लूप बंद LH116 लूप के तुलना मा तेजी से आरसी कारोबार के अनुमति दे सकत है, अऊर आरसी मा क्विनोन का प्रसार अधिक प्रतिबंधित हो सकत है। ई परीक्षण करै के खातिर कि का प्रोटीन डब्ल्यू आरसी के माध्यम से क्विनोन के रूपांतरण का प्रभावित करत है, हम यूबिक्विनोन 2 (यूक्यू 2) (एक छोट आइसोप्रीन पूंछ के साथ प्राकृतिक यूक्यू 10 का एक एनालॉग) (चित्र 2 ई) के एक निश्चित सांद्रता पर एक साइटोक्रोम ऑक्सीकरण परख किहिन। यद्यपि चीलेटेड क्विनोन के उपस्थिति स्पष्ट माइकलिस स्थिरांक (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू अऊर आरसी-एलएच116 क्रमशः 0.2±0.1μM अऊर 0.5±0.2μM के लिए उपयुक्त हैं) के सटीक निर्धारण मा बाधा डालत है, लेकिन आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (4.6±0202-0) के अधिकतम दर ( 4.6±022-1 ई-आरसी-) है। आरसी-एलएच116 (3.6±0.1 ई-आरसी-1 एस-1) से 28±5% बड़ा है।
हम शुरू मा अनुमान लगाये रहेन कि प्रोटीन-डब्ल्यू कोर कॉम्प्लेक्स (16) के लगभग 10% मा मौजूद है; हिंया, कम-रोशनी, मध्यम-रोशनी अऊर उच्च-रोशनी के विकास कोशिका के कब्जा दर क्रमशः 15±0.6%, 11±1% अऊर 0.9±0.5, % (चित्र 2एफ) है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के मात्रात्मक तुलना से पता चला कि हिस्टिडिन टैग के जोड़ से जंगली-प्रकार के उपभेदन (पी = 0.59) के तुलना मा प्रोटीन-डब्ल्यू के सापेक्ष बहुतायत कम नाहीं भै, यहिसे ई स्तर संशोधित प्रोटीन-डब्ल्यू (चित्र एस 10) के आर्टिफैक्ट नाहीं हैं। हालांकि, आरसी-एलएच 1 परिसर मा प्रोटीन-डब्ल्यू के ई कम कब्जा कुछ आरसी का त्वरित दर से पलटै के अनुमति दे सकत है, जेहिसे आरसी-एलएच 116 परिसर मा धीमा क्विनोन / क्विनोलोन विनिमय कम होइ सकत है। हम देखेन कि उच्च प्रकाश कब्जा दर हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के साथ असंगत है, जवन इंगित करत है कि pufW जीन अभिव्यक्ति मजबूत प्रकाश के तहत बढ़ जात है (चित्र S11) (23)। आरसी-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स मा pufW प्रतिलेखन अऊर प्रोटीन-डब्ल्यू समावेश के बीच अंतर भ्रमित करै वाला है अऊर प्रोटीन के जटिल विनियमन का दर्शा सकत है।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा, 6 कार्डियोलिपिन (सीडीएल), 7 फॉस्फेटिडाइलकोलाइन (पीओपीसी), 1 फॉस्फेटिडाइलग्लिसरॉल (पीओपीजी) अऊर 29 β-डीडीएम अणु आवंटित कीन जात हैं अऊर ओमा 6 सीडीएल, 24 पीओपीसी, 2 पीओपीजी अऊर 21बीडीएमडीएम मॉडलिंग कीन जात हैं। आरसी-एलएच116 (चित्र 5, ए अऊर बी)। इन दुइनौ संरचनाओं मा, सीडीएल लगभग परिसर के कोशिका द्रव्य पक्ष पर स्थित है, जबकि पीओपीसी, पीओपीजी अऊर β-डीडीएम ज्यादातर लुमिनल पक्ष पर स्थित हैं। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स (चित्र 5 ए) के αβ-1 से αβ-6 क्षेत्र मा दुई लिपिड अऊर डिटर्जेंट अणु अलग कीन गा रहें, अऊर पांच आरसी-एलएच116 (चित्र 5 बी) के समतुल्य क्षेत्र मा अलग कीन गा रहें। परिसर के दूसरी तरफ अधिक लिपिड पाए गए, मुख्य रूप से सीडीएल, आरसी अऊर αβ-7 से αβ-13 (चित्र 5, ए अऊर बी) के बीच जमा कीन गा रहा। अन्य संरचनात्मक रूप से हल कीन गा लिपिड अऊर डिटर्जेंट एलएच 1 रिंग के बाहर स्थित हैं, अऊर अच्छी तरह से हल कीन गा एसिल श्रृंखला एलएच 1 सबयूनिट के बीच फैली हुई है, जेका अस्थायी रूप से आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा β-डीडीएम के रूप मा नामित कीन गा है, अऊर आरसी ए β-डीडीएम अऊर पीओपीसी-एलएच16 के मिश्रण मा β-डीडीएम के रूप मा परिभाषित कीन गा है। हमरे संरचना मा चेलेटिंग लिपिड अऊर डिटर्जेंट के समान स्थिति बतावत है कि उ शारीरिक रूप से प्रासंगिक बाइंडिंग साइट हैं (चित्र S12A)। Tch मा समतुल्य अणुओं के स्थिति मा भी अच्छी स्थिरता है। कोमल अऊर ट्रव। तनाव 970 आरसी-एलएच 1s (चित्र एस 12, बी से ई) (9, 12) अऊर लिपिड हेड समूह के हाइड्रोजन-बंधन अवशेष अनुक्रम संरेखण (चित्र एस 13) मा काफी अच्छा संरक्षण देखाइस, जेसे पता चलत है कि संरक्षित सीडीएल जवन आरसी (24) से बंधत है, ई साइट आरसीएच-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स मा संरक्षित होइ सकत हैं।
(ए अऊर बी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए) अऊर आरसी-एलएच116 (बी) पेप्टाइड कार्टून द्वारा दर्शाए जात हैं, अऊर वर्णक छड़ द्वारा दर्शाए जात हैं, चित्र 1 मा रंग योजना का उपयोग करत हैं। लिपिड लाल रंग मा देखावा जात हैं, अऊर डिटर्जेंट ग्रे रंग मा देखावा जात हैं। आरसी क्यूए अऊर क्यूबी साइटन से बंधा यूक्यू पीला है, जबकि अलग-थलग यूक्यू नीला है। (सी अऊर डी) (ए) अऊर (बी) के समान विचार, लिपिड छोड़े गए हैं। (ई से जी) आरसी-एलएच116 से क्यू1(ई), क्यू2(एफ) अऊर क्यू3(जी) का बढ़ल दृश्य, साइड चेन के साथ जवन एक दूसर का प्रभावित करत हैं। हाइड्रोजन बंधन काली धराशायी रेखा के रूप मा देखावा गा है।
आरसी-एलएच116 मा, आरसी क्यूए अऊर क्यूबी यूक्यू दुनौ, जवन आवेश पृथक्करण प्रक्रिया मा इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण मा भाग लेत हैं, ओनके बाइंडिंग साइटन मा विघटित होइ जात हैं। हालांकि, आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा, क्यूबी क्विनोन का हल नाहीं कीन गा है अऊर नीचे विस्तार से चर्चा कीन जाई। क्यूए अऊर क्यूबी क्विनोन के अलावा, दुई चेलेटेड यूक्यू अणु (आरसी अऊर एलएच 1 रिंग के बीच स्थित) आरसी-एलएच 114-डब्ल्यू संरचना मा उनके अच्छी तरह से हल कीन गा हेड समूहन (क्रमशः क्यू 1 अऊर क्यू 2 मा स्थित) के अनुसार आवंटित कीन जात हैं। जगा)। चित्र 5सी)। Q1 मा दुई आइसोप्रीन इकाइयन का सौंपा जात है, अऊर घनत्व मानचित्र Q2 के पूरा 10 आइसोप्रीन पूंछ का हल करत है। आरसी-एलएच116 के संरचना मा, तीन चेलेटेड यूक्यू10 अणु (क्यू1 से क्यू3, चित्र 5डी) हल कीन गा रहें, अऊर सब अणुओं मा पूंछ मा एक स्पष्ट घनत्व होत है (चित्र 5, डी से जी)। दुइनौ संरचना मा, क्यू 1 अऊर क्यू 2 के क्विनोन हेड समूहन के स्थिति मा उत्कृष्ट स्थिरता है (चित्र एस 12 एफ), अऊर उ केवल आरसी के साथ बातचीत करत हैं। क्यू 1 आरसी-एलएच 114-डब्ल्यू (चित्र 1 जी अऊर 5, सी, डी अऊर ई) के डब्ल्यू गैप के प्रवेश द्वार पर स्थित है, अऊर क्यू 2 क्यूबी बाइंडिंग साइट (चित्र 5, सी, डी) अऊर एफ के पास स्थित है। संरक्षित L-Trp143 अऊर L-Trp269 अवशेष Q1 अऊर Q2 के बहुत करीब हैं अऊर संभावित π-स्टैकिंग इंटरैक्शन प्रदान करत हैं (चित्र 5, ई अऊर एफ, अऊर चित्र S12)। एल-जीएलएन88, क्यू 1 के दूरस्थ ऑक्सीजन से 3.0 Å, एक मजबूत हाइड्रोजन बंधन प्रदान करत है (चित्र 5 ई); ई अवशेष सबसे दूर के संबंध (चित्र S13) के छोड़के सब आरसी मा संरक्षित अहै। एल-सेर91 अधिकांश अन्य आरसी (चित्र एस 13) मा थ्र के लिए रूढ़िवादी रूप से प्रतिस्थापित है, क्यू 1 के मिथाइल ऑक्सीजन से 3.8 एंगस्ट्रॉम है, अऊर कमजोर हाइड्रोजन बंध प्रदान कर सकत है (चित्र 5 ई)। क्यू 3 मा कौनो विशिष्ट बातचीत नाहीं दिखाई देत है, लेकिन ई आरसी-एम सबयूनिट अऊर एलएच 1-α सबयूनिट 5 से 6 (चित्र 5, डी अऊर जी) के बीच हाइड्रोफोबिक क्षेत्र मा स्थित है। क्यू 1, क्यू 2 अऊर क्यू 3 या पास के चीलेटेड क्विनोन भी टीएच मा हल कीन गा अहै। कोमल, टीआरवी। तनाव 970 अऊर बीएलसी। परितारिका संरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच 1 परिसर (चित्र एस 12 जी) मा एक संरक्षित सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट के ओर इशारा करत है। आरसी-एलएच116 मा पांच अपघटित यूक्यू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित प्रत्येक परिसर के 5.8±0.7 के साथ अच्छा समझौता मा हैं, जबकि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा तीन अपघटित यूक्यू 6.2±0.3 (चित्र एस14) के मापा मान से कम हैं, इंगित करत है कि यूक्यू अणु हल नाहीं हैं। रूप।
छद्म-सममित एल अऊर एम पॉलीपेप्टाइड्स मा हर एक मा पाँच टीएमएच होत हैं अऊर एक हेटरोडाइमर बनावत हैं जवन एक बीसीएचएल डाइमर, दुई बीसीएचएल मोनोमर्स, दुई बैक्टीरियोफेज (बीपीएच) मोनोमर्स अऊर एक गैर-हीम आयरन अऊर एक या दुई यूक्यू10 अणुओं का जोड़त है। टर्मिनल कीटोन समूह पर हाइड्रोजन बांड के उपस्थिति अऊर आरपीएस मा एकर ज्ञात संचय के माध्यम से, कैरोटीनॉयड एम-सबयूनिट मा शामिल कीन जात हैं, जेकर नाम सिस-3,4-डीहाइड्रोहोडोपिन है। प्रजाति (25) आरसी-एच का बाहरी झिल्ली डोमेन एक एकल टीएमएच द्वारा झिल्ली से लंगर डाला जात है। समग्र आरसी संरचना संबंधित प्रजातियन (जैसे आरबीए) के तीन सबयूनिट आरसी के समान है। स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 3आई4डी)। बीसीएचएल अऊर बीपीएच के मैक्रोसाइकिल, कैरोटीनॉइड बैकबोन अऊर नॉन-हीम आयरन इन संरचनाओं के रिज़ॉल्यूशन रेंज के भीतर ओवरलैप करत हैं, जइसे कि क्यूए साइट पर यूक्यू10 हेड ग्रुप अऊर आरसी-एलएच116 (चित्र एस15) पर क्यूबी क्विनोन करत हैं।
अलग-अलग क्यूबी साइट कब्जा दर के साथ दुई आरसी संरचनाओं के उपलब्धता क्यूबी क्विनोन बाइंडिंग के साथ सुसंगत संरचनात्मक परिवर्तनन के जांच करै का एक नया अवसर प्रदान करत है। आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स मा, क्यूबी क्विनोन पूरी तरह से बाध्य "समीपस्थ" स्थिति (26) मा स्थित है, लेकिन आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के पृथक्करण मा क्यूबी क्विनोन नाहीं है। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू मा कौनो क्यूबी क्विनोन नाहीं है, जवन आश्चर्यजनक है काहे से कि कॉम्प्लेक्स सक्रिय है, संरचनात्मक रूप से हल कीन गा क्यूबी क्विनोन के साथ आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स से ज्यादा। यद्यपि दुई एलएच 1 रिंग लगभग छह क्विनोन चीलेट करत हैं, पांच बंद आरसी-एलएच 116 रिंग मा संरचनात्मक रूप से हल होत हैं, जबकि खुले आरसी-एलएच 114-डब्ल्यू रिंग मा केवल तीन संरचनात्मक रूप से सीमित होत हैं। ई बढ़ल संरचनात्मक विकार आरसी-एलएच114-डब्ल्यू क्यूबी साइटन के तेजी से प्रतिस्थापन, परिसर मा तेजी से क्विनोन गतिकी अऊर एलएच 1 लूप का पार करै के बढ़ल संभावना का दर्शा सकत है। हम सुझाव देत हैं कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के आरसी क्यूबी साइट मा यूक्यू के कमी एक अधिक जटिल अऊर अधिक सक्रिय परिसर का परिणाम हो सकत है, अऊर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के क्यूबी साइट का यूक्यू कारोबार मा तुरंत जम दीन गा है विशिष्ट चरण (क्यूबी साइट का प्रवेश द्वार बंद कर दीन गा है) ई गतिविधि के संरचना का दर्शाता है।
क्यूबी के बिना, एल-फे217 का साथ मा घूर्णन एक अइसन स्थिति मा होत है जवन यूक्यू10 बाइंडिंग के साथ असंगत है, काहे से कि ई पूंछ के पहिला आइसोप्रीन इकाई के साथे स्थानिक टकराव का कारण बनी (चित्र 6 ए)। यहिके अलावा, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक परिवर्तन स्पष्ट हैं, खासकर हेलिक्स डी (टीएमएच डी अऊर ई के बीच लूप मा छोट हेलिक्स) जहां एल-फे217 का क्यूबी बाइंडिंग पॉकेट मा स्थानांतरित कीन जात है अऊर एल-टायर223 का घूर्णन (चित्र 6 ए) एम-एपी 5 फ्रेमवर्क के साथ हाइड्रोजन बंधन का तोड़ै के लिए अऊर क्यूबी के बाइंडिंग का अंत बंद करत है साइट (चित्र 6 बी)। हेलिक्स डी अपने आधार पर धुरी बनावत है, L-Ser209 का Cα 0.33Å से स्थानांतरित होत है, जबकि L-Val221Cα 3.52Å से स्थानांतरित होत है। टीएमएच डी अऊर ई मा कौनो अवलोकन योग्य परिवर्तन नाहीं है, जवन दुइनौ संरचनाओं मा सुपरइम्पोजेबल हैं (चित्र 6 ए)। जहाँ तक हम जानित है, ई प्राकृतिक आरसी मा पहिला संरचना है जवन क्यूबी साइट का बंद करत है। पूर्ण (क्यूबी-बाउंड) संरचना के साथ तुलना से पता चलत है कि क्विनोन के कम होवे से पहिले, क्विनोन मा प्रवेश करै के लिए एक संरचनात्मक परिवर्तन के आवश्यकता होत है। एल-फे217 क्विनोन हेड समूह के साथे π-स्टैकिंग इंटरैक्शन बनावै के लिए घूमत है, अऊर हेलिक्स बाहर के ओर शिफ्ट हो जात है, जेहिसे एल-ग्लाइ222 के कंकाल अऊर एल-टायर223 के साइड चेन एक स्थिर हाइड्रोजन बॉन्ड संरचना (चित्र 6, ए अऊर सी) के साथ एक हाइड्रोजन बॉन्ड नेटवर्क बनावै के अनुमति देत है।
(A) होलोग्राम (एल चेन, ऑरेंज/एम चेन, मैजेंटा) अऊर एपो (ग्रे) संरचना का ओवरलैपिंग कार्टून, जेहिमा प्रमुख अवशेषन का रॉड-जैसे प्रतिनिधित्व के रूप मा प्रदर्शित कीन जात है। यूक्यू10 का प्रतिनिधित्व एक पीली पट्टी से कीन जात है। बिंदीदार रेखा पूरी संरचना मा बने हाइड्रोजन बंधन का इंगित करत है। (बी अऊर सी) एपोलिपोप्रोटीन अऊर पूरी रिंग संरचना का सतह प्रतिनिधित्व, क्रमशः नीले रंग मा एल-फे217 अऊर लाल रंग मा एल-टायर223 के साइड चेन ऑक्सीजन का उजागर करत है। एल सबयूनिट नारंगी है; एम अऊर एच सबयूनिट रंगीन नाहीं हैं। (डी अऊर ई) एपोलिपोप्रोटीन (डी) अऊर पूरा (ई) आरसी क्यूबी साइट [क्रमशः (ए) द्वारा रंग] अऊर थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएसआईआई (प्लास्टिक क्विनोन के साथ हरा, नीला; पीडीबी आईडी: 3डब्ल्यूयू 2) संरेखित (58)।
अप्रत्याशित रूप से, यद्यपि एलएच 1 के बिना क्यूबी-कमी वाले आरसी के कईयो संरचना उपलब्ध हैं, लेकिन यहि अध्ययन मा देखे गए संरचनात्मक परिवर्तन पहिले रिपोर्ट नाहीं कीन गा हैं। इनमा बीएलसी से क्यूबी कमी संरचना शामिल है। विरिडिस (पीडीबी आईडी: 3पीआरसी) (27), टीएच। टेपिडम (पीडीबी आईडी: 1ईवाईएस) (28) अऊर आरबीए। स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 1ओजीवी) (29), जेहिमा से सब लगभग ओनके समग्र क्यूबी संरचना के समान हैं। 3PRC के करीबी निरीक्षण से पता चला कि LDAO (लॉरिल डाइमिथाइल अमीन ऑक्साइड) डिटर्जेंट अणु QB स्थिति के प्रवेश द्वार पर बंध जात हैं, जवन एक बंद संरचना मा पुनर्व्यवस्था का रोक सकत है। यद्यपि एलडीएओ 1ईवाईएस या 1ओजीवी मा एकै स्थिति मा विघटित नाहीं होत है, लेकिन ई आरसी एकै डिटर्जेंट का उपयोग कइके तैयार कीन जात हैं अऊर यहिसे एकै प्रभाव पैदा कइ सकत हैं। आरबीए के क्रिस्टल संरचना। साइटोक्रोम सी 2 (पीडीबी आईडी: 1 एल 9 बी) के साथ सह-क्रिस्टलीकृत स्फेरोइड्स आरसी मा भी एक बंद क्यूबी साइट लागत है। हालांकि, यहि मामला मा, आरसी-एम पॉलीपेप्टाइड का एन-टर्मिनल क्षेत्र (क्यू हेलिक्स पर टायर अवशेष के एच बंधन के माध्यम से क्यूबी बाइंडिंग साइट के साथ बातचीत करत है) एक अप्राकृतिक संरचना अपनावत है, अऊर क्यूबी संरचनात्मक परिवर्तन का आगे पता नहीं लगावा जात है (30)। आश्वस्त करै वाली बात ई है कि हम आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना मा एम पॉलीपेप्टाइड के इ तरह के विरूपण नाहीं देखेन, जवन लगभग आरसी-एलएच116 आरसी के एन-टर्मिनल क्षेत्र के समान है। ई भी ध्यान दिया जाय कि डिटर्जेंट-आधारित एलएच 1 एंटीना के उन्मूलन के बाद, पीडीबी मा एपोलिपोप्रोटीन आरसी हल होइ गए, जेहिसे आरसी अऊर आसपास के एलएच 1 रिंग के आंतरिक सतह के बीच के अंतराल मा आंतरिक क्विनोन पूल अऊर लिपिड खतम होइ गए (31, 32)। आरसी कार्यात्मक रहत है काहे से कि ई सब सहकारक का बरकरार रखत है, सिवाय अपघटन योग्य क्यूबी क्विनोन के, जवन कम स्थिर होत है अऊर अक्सर तैयारी प्रक्रिया के दौरान खो जात है (33)। यहिके अलावा, ई ज्ञात है कि आरसी से एलएच 1 अऊर प्राकृतिक चक्रीय लिपिड के हटावे से कार्यन पर प्रभाव पड़ सकत है, जइसे कि चार्ज-अलग पी + क्यूबी-राज्य (31, 34, 35) के छोटा जीवन काल। यहिसे, हम अनुमान लगावत हैं कि आरसी के आसपास के स्थानीय एलएच 1 रिंग के अस्तित्व "बंद" क्यूबी साइट का बनाए रख सकत है, जेहिसे क्यूबी के पास स्थानीय वातावरण का संरक्षित कीन जा सकत है।
यद्यपि एपोलिपोप्रोटीन (क्यूबी क्विनोन के बिना) अऊर पूरा संरचना घटनाओं के एक श्रृंखला के बजाय क्यूबी साइट के कारोबार के केवल दुई स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करत हैं, संकेत हैं कि बाइंडिंग का हाइड्रोक्विनोन द्वारा पुन: बाइंडिंग का रोकै के लिए गेट कीन जा सकत है सब्सट्रेट निषेध का रोकै के लिए। एपोलिपोप्रोटीन के क्यूबी साइट के पास क्विनोलोल अऊर क्विनोन के परस्पर क्रिया अलग हो सकत है, जेहिसे आरसी द्वारा एकर अस्वीकृति होत है। ई लंबे समय से प्रस्तावित कीन जात है कि संरचनात्मक परिवर्तन क्विनोन के बंधन अऊर कमी मा एक भूमिका निभात हैं। अंधेरे अनुकूलन के बाद क्विनोन का कम करै के लिए जमे हुए आरसी के क्षमता बिगड़ जात है (36); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से पता चलत है कि ई क्षति सक्रिय समीपस्थ स्थिति (26) , 37) से लगभग 4.5 Å के "दूरस्थ" संरचना मा फंसे क्यूबी क्विनोन के कारण होत है। हम सुझाव देत हैं कि ई दूरस्थ बंधन संरचना एपोलिपोप्रोटीन अऊर पूर्ण रिंग संरचना के बीच मध्यवर्ती अवस्था का एक स्नैपशॉट है, जवन क्विनोन के साथ प्रारंभिक बातचीत अऊर क्यूबी साइट के उद्घाटन के बाद होत है।
कुछ फोटोट्रॉफिक बैक्टीरिया अऊर सायनोबैक्टीरिया, शैवाल अऊर पौधन के पीएसआईआई परिसर मा पावा जाय वाला टाइप II आरसी मा संरचनात्मक अऊर कार्यात्मक संरक्षण है (38)। चित्र 6 (डी अऊर ई) मा देखावा गा संरचनात्मक संरेखण पीएसआईआई आरसी अऊर जीवाणु आरसी परिसर के क्यूबी साइट के बीच समानता पर जोर देत है। ई तुलना लंबे समय से क्विनोन बाइंडिंग अऊर रिडक्शन के निकट संबंधित प्रणालिन के अध्ययन करै के लिए एक मॉडल रहा है। पिछले प्रकाशन से पता चला है कि संरचनात्मक परिवर्तन क्विनोन (39, 40) के पीएसआईआई कमी के साथ होत हैं। यहिसे, आरसी के विकासवादी संरक्षण का देखत हुए, ई पहिले से अनदेखा बंधन तंत्र ऑक्सीजन युक्त फोटोट्रॉफिक पौधन मा पीएसआईआई आरसी के क्यूबी साइट पर भी लागू होइ सकत है।
आरपीएस ΔpufW (अनलेबल pufW विलोपन) अऊर PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टैग प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकस से व्यक्त) उपभेद। palustris CGA009 का वर्णन हमरे पिछले काम (16) मा कीन गा रहा। ई उपभेदन अऊर आइसोजेनिक जंगली-प्रकार के माता-पिता का फ्रीजर से पीवाईई (प्रत्येक 5 ग्राम लीटर -1) (-80 °C पर एलबी मा संग्रहीत, जेहिमा 50% (w/v) ग्लिसरॉल) प्रोटीन, खमीर अर्क अऊर सक्सीनेट) अगर [1.5%/v) (w/v) प्लेट पर थोड़ी संख्या मा कोशिका लकीर लगाके बरामद कीन गा रहा। प्लेट का अवायवीय परिस्थितियन मा कमरा के तापमान पर रात भर अंधेरे मा ऊष्मायन करा गा रहा, अऊर फिर ओएसआरएएम 116-डब्ल्यू हैलोजन बल्ब (आरएस कम्पोनेंट्स, यूके) द्वारा प्रदान कीन गा सफेद रोशनी (~ 50 μmolm-2 s-1) से 3 से 5 दिन तक रोशन कीन गा रहा जब तक कि एक एकल कॉलोनी दिखाई न दे। एक एकल कॉलोनी का उपयोग 0.1% (w/v) कासामिनो एसिड (यहिके बाद M22 के रूप मा संदर्भित) के साथ पूरक M22+ माध्यम (41) के 10 मिलीलीटर का टीका लगावै के लिए कीन गा रहा। संस्कृति का 34°C पर अंधेरे मा कम ऑक्सीजन के स्थिति मा 48 घंटा तक 180 आरपीएम पर हिलावै के साथ उगावा गा रहा, अऊर फिर 24 घंटा के लिए उहै परिस्थितियन मा 70 मिलीलीटर संस्कृति का टीका लगावा गा रहा। मिलीलीटर के आयतन के साथ एक अर्ध-एरोबिक संस्कृति का उपयोग 30 मिलीलीटर सार्वभौमिक स्क्रू-टॉप पारदर्शी कांच के बोतल मा 30 मिलीलीटर एम 22 माध्यम का टीका लगावै के लिए कीन जात है अऊर बाँझ चुंबकीय बल स्टिरिंग रॉड द्वारा 48 घंटे के लिए आंदोलन (~ 50 μmolm-2 s-1) के साथ विकिरणित कीन जात है। फिर 30 मिलीलीटर संस्कृति का उहै परिस्थितियन मा लगभग 1 लीटर संस्कृति के साथ टीका लगावा गा रहा, जेहिका तब 72 घंटा के लिए ~200 μmolm-2 s-1 पर रोशन लगभग 9 लीटर संस्कृति का टीका लगावै के लिए उपयोग कीन गा रहा। कोशिका 30 मिनट के लिए 7132 आरसीएफ पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा काटी गईं, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) के ~10 मिलीलीटर में पुन: निलंबित कीन गै रहीं, अऊर जरूरत पड़ै तक -20°C पर संग्रहीत कीन गै रहीं।
पिघलने के बाद, पुन: निलंबित कोशिकाओं में डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिअस I (मर्क, यूके), लाइसोजाइम (मर्क, यूके) अऊर दुई रोश होलोएंजाइम प्रोटीज इनहिबिटर टैबलेट (मर्क, यूके) के कुछ क्रिस्टल जोड़ौ। एक 20,000 पीएसआई फ्रेंच प्रेशर सेल (अमींको, यूएसए) मा, कोशिका 8 से 12 बार बाधित कीन गै रहीं। 4°C पर 15 मिनट के लिए 18,500 RCF पर अपकेंद्रण द्वारा अखंड कोशिकाओं अऊर अघुलनशील मलबे का हटावै के बाद, झिल्ली का 43,000°C पर 2 घंटे के लिए 113,000 RCF पर अपकेंद्रण द्वारा रंगद्रव्य लाइसेट से अवक्षेपित कीन गा रहा। घुलनशील अंश का त्याग करा अऊर 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) के 100 से 200 मिलीलीटर मा रंगीन झिल्ली का फिर से निलंबित करा अऊर तब तक समरूप बनावा जब तक कि कौनो दृश्य समुच्चय न हो। निलंबित झिल्ली का 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) (एनाट्रेस, यूएसए) मा 2% (डब्ल्यू/वी) β-डीडीएम युक्त 4°C पर अंधेरे मा 1 घंटा के लिए कोमल सरगर्मी के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। फिर अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थन का हटावै के लिए 150,000 आरसीएफ का 4°C पर 1 घंटा के लिए भंग करै के लिए 70°C पर सेंट्रीफ्यूज करा।
ΔpufW तनाव से घुलनशील झिल्ली का बाइंडिंग बफर [20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) युक्त 0.03% (डब्ल्यू / वी) β-डीडीएम] के तीन कॉलम वॉल्यूम (सीवी) के साथ 50 मिलीलीटर डीईएई सेफरोज आयन विनिमय कॉलम पर लागू कीन गा रहा। कॉलम का दुई सीवी बाइंडिंग बफर से धोवा, अऊर फिर 50 एमएम एनएसीएल युक्त दुई बाइंडिंग बफर से कॉलम का धोवा। आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स का 1.75 सीवी पर 150 से 300 एमएम एनएसीएल (बाइंडिंग बफर मा) के रैखिक ढाल के साथ अलग कीन गा रहा, अऊर शेष बाइंडिंग कॉम्प्लेक्स का 0.5 सीवी पर 300 एमएम एनएसीएल युक्त बाइंडिंग बफर के साथ अलग कीन गा रहा। 250 अऊर 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करा, 880 से 280 एनएम पर 1 से अधिक अवशोषण अनुपात (A880/A280) वाला अंश रखौ, बाइंडिंग बफर मा दुइ बार पतला करा, अऊर शुद्धिकरण पर डीईएई कॉलम पर फिर से वही प्रक्रिया का उपयोग करा। 1.7 से अधिक A880/A280 अनुपात अऊर 3.0 से अधिक A880/A805 अनुपात वाले अंशों का पतला करा, आयन विनिमय का तीसरा दौर करा, अऊर 2.2 से अधिक A880/A280 अनुपात अऊर A880/A805 अनुपात 0.05 से अधिक वाले अंशों का बनाए रखौ। आंशिक रूप से शुद्ध परिसर का एक एमिकॉन 100,000 आणविक भार कट-ऑफ (एमडब्ल्यूसीओ) केन्द्रापसारक फिल्टर (मर्क, यूके) मा ~2 मिलीलीटर तक केंद्रित कीन गा रहा, अऊर एक सुपरडेक्स 200 16/600 आकार बहिष्कार स्तंभ (जीई हेल्थकेयर, यूएस) पर लोड कीन गा रहा जेहिमा 200 एमएम नाल बफर रहा अऊर फिर उहै बफर 15 मा निष्कासित कीन गा रहा। सी.वी. आकार बहिष्करण अंश के अवशोषण स्पेक्ट्रा एकत्र करा, अऊर अवशोषण स्पेक्ट्रा का 2.4 से अधिक A880/A280 अनुपात अऊर 5.8 से 100 A880 से अधिक A880/A805 अनुपात के साथ केंद्रित करा, अऊर तुरंत ओनका क्रायो-टीईएम ग्रिड तैयारी या भंडारण के लिए उपयोग करा जब तक कि आवश्यक न होय
PufW-His तनाव से घुलनशील झिल्ली का 20 मिलीलीटर HisPrep FF Ni-NTA सेफरोज कॉलम (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) जेहिमा 200 एमएम एनएसीएल अऊर 0.03% (डब्ल्यू/डब्ल्यू) रहा) का आईएमएसी बफर (जीई हेल्थकेयर) मा लगावा गा रहा। v) β-DDM]. कॉलम का आईएमएसी बफर के पांच सीवी से धोवा गा रहा, अऊर फिर 10 एमएम हिस्टिडिन युक्त आईएमएसी बफर के पांच सीवी से धोवा गा रहा। कोर कॉम्प्लेक्स का 100 एमएम हिस्टिडिन युक्त पांच आईएमएसी बफर के साथ कॉलम से अलग कीन गा रहा। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स युक्त अंश का एक एमिकॉन 100,000 एमडब्ल्यूसीओ फिल्टर (मर्क, यूके) से सुसज्जित एक हलचल टैंक मा ~10 मिलीलीटर तक केंद्रित कीन जात है, बाइंडिंग बफर के साथ 20 बार पतला कीन जात है, अऊर फिर 25 मिलीलीटर मा जोड़ा जात है डीईएई सेफारोज कॉलम मा, बफर मा चार सीवी का उपयोग कीन जात है। कॉलम का चार सीवी बाइंडिंग बफर से धोवा, फिर 0 से 100 एमएम एनएसीएल (बाइंडिंग बफर मा) के रैखिक ढाल पर आठ सीवी पर कॉम्प्लेक्स का एल्यूट करा, अऊर 100 एमएम बाइंडिंग बफर युक्त शेष चार सीवी। सोडियम क्लोराइड पर एल्यूट कीन गा अवशिष्ट कॉम्प्लेक्स 2088A/200A अनुपात से अधिक है। A880/A805 अनुपात 4.6 से अधिक अंश एक एमिकॉन 100,000 MWCO केन्द्रापसारक फिल्टर मा ~2 मिलीलीटर तक केंद्रित कीन गा रहा, अऊर अग्रिम मा 1.5 CV IMAC से भरा गा रहा बफर संतुलित सुपरडेक्स 200 16/600 आकार के बहिष्करण कॉलम, अऊर फिर उहै बफर मा CV 1.5. आकार-बहिष्करण अंश के अवशोषण स्पेक्ट्रा एकत्र करा अऊर अवशोषण स्पेक्ट्रा का 2.1 से अधिक A880/A280 अनुपात अऊर 4.6 से 100 A880 से अधिक A880/A805 अनुपात के साथ केंद्रित करा, जेका तुरंत जमे हुए टीईएम ग्रिड तैयारी के लिए उपयोग कीन जात है या जरूरत तक -80°C पर संग्रहीत कीन जात है।
कम तापमान टीईएम ग्रिड तैयार करै के लिए एक लीका ईएम जीपी इमर्सन फ्रीजर का उपयोग कीन गा रहा। कॉम्प्लेक्स का IMAC बफर मा 50 के A880 तक पतला कीन गा रहा, अऊर फिर 5μl का एक नए ग्लो-डिस्चार्ज QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित तांबा जाली (अगर साइंटिफिक, यूके) पर लोड कीन गा रहा। ग्रिड का 20°C अऊर 60% सापेक्ष आर्द्रता पर 30 सेकंड के लिए ऊष्मायन करा, फिर 3 सेकंड के लिए ओका सूखा धोवा, अऊर फिर ओका -176°C पर तरल ईथेन मा बुझावा।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स का डेटा एक टाइटन क्रियोस माइक्रोस्कोप के साथ ईबीआईसी (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) पर दर्ज कीन गा रहा, जवन 300 किलोवी के त्वरित वोल्टेज पर काम करत है, 130,000 × के नाममात्र आवर्धन अऊर 20 ई वी के चो-से गैप के ऊर्जा के साथ। डेटा एकत्र करै के लिए गिनती मोड मा छवियन का रिकॉर्ड करै के लिए के 2 पीक डिटेक्टर के साथ एक गैटन 968 जीआईएफ क्वांटम का उपयोग कीन गा रहा। कैलिब्रेटेड पिक्सेल आकार 1.048Å है, अऊर खुराक दर 3.83 ई-Å-2s-1 है। सेकंड मा मूवी एकत्र किहिन अऊर ओका 40 भागन मा विभाजित किहिन। माइक्रोस्कोप का फिर से केंद्रित करै के लिए कार्बन-लेपित क्षेत्र का उपयोग करा, अऊर फिर प्रति छेद तीन मूवी एकत्र करा। कुल मिला के, 3130 फिल्में एकत्रित कीन गै रहीं, जेहिमा -1 अऊर -3μm के बीच डिफोकस मान रहे।
आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स के लिए डेटा एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लेबोरेटरी (लीड्स विश्वविद्यालय, यूके) मा एकै माइक्रोस्कोप का उपयोग कइके एकत्रित कीन गा रहा। डेटा 130 k के आवर्धन के साथ गिनती मोड मा एकत्रित कीन गा रहा, अऊर पिक्सेल आकार का 4.6 e-Å-2s-1 के खुराक के साथ 1.065 Å तक कैलिब्रेट कीन गा रहा। ई मूवी 12 सेकंड मा रिकॉर्ड कीन गा रहा अऊर 48 भागन मा विभाजित कीन गा रहा। कुल मिला के, 3359 फिल्में एकत्र कीन गै रहीं, जेहिमा -1 अऊर -3μm के बीच डिफोकस मान रहे।
सब डेटा प्रोसेसिंग रिलियन 3.0 पाइपलाइन (42) मा कीन जात है। खुराक भार से बीम गति का सही करै के लिए मोशनकोर 2 (43) का उपयोग करा, अऊर फिर सीटीएफ (कंट्रास्ट ट्रांसफर फंक्शन) पैरामीटर का निर्धारित करै के लिए सीटीएफआईएनडी 4.1 (44) का उपयोग करा। इन प्रारंभिक प्रसंस्करण चरणन के बाद विशिष्ट फोटोमाइक्रोग्राफ चित्र 2. S16 मा देखावा गा है। स्वचालित चयन टेम्पलेट 250-पिक्सेल फ्रेम अऊर कौनो संदर्भ द्वि-आयामी (2डी) वर्गीकरण मा 1000 कणन के लगभग 250 पिक्सेल का मैन्युअल रूप से चयन कइके उत्पन्न कीन जात है, जेहिसे ओन वर्गीकरणन का खारिज कीन जात है जवन नमूना संदूषण का पूरा करत हैं या जेकर कौनो स्पष्ट विशेषता नाहीं है। फिर, सब माइक्रोफोटोग्राफ पर स्वचालित चयन कीन गा रहा, अऊर आरसी-एलएच114-डब्ल्यू 849,359 कण रहे, अऊर आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स 476,547 कण रहे। सब चयनित कण गैर-संदर्भ 2D वर्गीकरण के दुई दौर से गुजर चुके हैं, अऊर हर रन के बाद, कार्बन क्षेत्र, नमूना संदूषण, कौनो स्पष्ट विशेषता या दृढ़ता से ओवरलैपिंग कणन का पूरा करै वाले कणन का खारिज कर दीन जात है, जेकरे परिणामस्वरूप 772,033 (90.9%) अऊर 359,678 (75.5) कण 3D वर्गीकरण के लिए उपयोग कीन जात हैं। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू अऊर आरसी-एलएच116 क्रमशः। प्रारंभिक 3डी संदर्भ मॉडल स्टोकैस्टिक ढाल वंश विधि का उपयोग कइके बनावा गा रहा। संदर्भ के रूप मा प्रारंभिक मॉडल का उपयोग करत हुए, चयनित कणन का 3डी मा चार श्रेणियन मा वर्गीकृत कीन जात है। संदर्भ के रूप मा यहि श्रेणी मा मॉडल का उपयोग करत हुए, सबसे बड़ी श्रेणी मा कणन पर 3डी शोधन करा, फिर विलायक क्षेत्र का कवर करै के लिए प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर का उपयोग करा, नरम किनारन के 6 पिक्सेल जोड़ा, अऊर शीर्ष डिटेक्टर के गैटन के 2 पीक मॉड्यूलेशन ट्रांसफर फंक्शन का सही करै के लिए पिक्सेल का पोस्ट-प्रोसेस करा। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू डेटासेट के लिए, ई प्रारंभिक मॉडल का मास्क के किनारे पर मजबूत घनत्व का हटा के संशोधित कीन गा रहा (यूसीएसएफ चिमेरा मा कोर कॉम्प्लेक्स घनत्व से अलग)। परिणामी मॉडल (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू अऊर आरसी-एलएच116 के रिज़ॉल्यूशन क्रमशः 3.91 अऊर 4.16 Å हैं) 3डी वर्गीकरण के दूसर दौर के संदर्भ के रूप मा उपयोग कीन जात हैं। उपयोग कीन गा कणन का प्रारंभिक 3डी वर्ग मा समूहीकृत कीन जात है अऊर ओनमा पड़ोस के साथ मजबूत सहसंबंध नाहीं होत है। ओवरलैप या स्पष्ट संरचनात्मक विशेषता के कमी। 3डी वर्गीकरण के दूसर दौर के बाद, सबसे अधिक रिज़ॉल्यूशन वाली श्रेणी का चयन कीन गा रहा [आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के लिए, एक श्रेणी 377,703 कण (44.5%) है, आरसी-एलएच116 के लिए, दुई श्रेणियाँ हैं, कुल 260,752 कण (54.77 डब्ल्यू) हैं, जब उ एकै बाद एकै होत हैं, जब उ केवल एकै बाद एकै होत हैं। थोड़े अंतर के साथ प्रारंभिक घूर्णन]। चयनित कणन का 400-पिक्सेल बॉक्स मा फिर से निकाला जात है अऊर 3डी रिफाइनिंग द्वारा परिष्कृत कीन जात है। विलायक मास्क प्रारंभिक 15Å लो-पास फिल्टर, 3 पिक्सेल मैप विस्तार अऊर 3 पिक्सेल सॉफ्ट मास्क का उपयोग कइके बनावा जात है। प्रति-कण सीटीएफ परिष्करण, प्रति-कण गति सुधार अऊर प्रति-कण सीटीएफ परिष्करण के दूसर दौर का उपयोग करत हुए, परिणामी बनावट का अउर परिष्कृत करै के लिए हर चरण के बाद 3डी परिष्करण, विलायक मास्किंग अऊर पोस्ट-प्रोसेसिंग कीन जात है। 0.143 के एफएससी (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मान का उपयोग करत हुए, आरसी-एलएच114-डब्ल्यू अऊर आरसी-एलएच116 के अंतिम मॉडल के रिज़ॉल्यूशन क्रमशः 2.65 अऊर 2.80Å हैं। अंतिम मॉडल का एफएससी वक्र चित्र 2 मा देखावा गा है। S17।
सब प्रोटीन अनुक्रम यूनिप्रोटकेबी से डाउनलोड कीन जात हैं: एलएच 1-β (पफबी; यूनिप्रोट आईडी: क्यू 6 एन 9 एल 5); एलएच1-α (पफए; यूनिप्रोटआईडी: क्यू6एन9एल4); आरसी-एल (पफएल; यूनिप्रोट आईडी: ओ83005); आरसी-एम (पफएम; यूनिप्रोट आईडी: ए0ए4जेड7); आरसी-एच (पुहा; यूनिप्रोट आईडी: ए0ए4जेड9); प्रोटीन-डब्ल्यू (पफडब्ल्यू; यूनिप्रोट आईडी: क्यू 6 एन 1 के 3)। आरसी के एक होमोलॉजी मॉडल बनावै के लिए स्विस-मॉडल (45) का उपयोग कीन गा रहा, जेहिमा आरसी-एल, आरसी-एम अऊर आरसी-एच के प्रोटीन अनुक्रम अऊर आरबीए के क्रिस्टल संरचना शामिल है। स्फेरोइड्स आरसी का उपयोग एक टेम्पलेट (पीडीबी आईडी: 5एलएसई) (46) के रूप मा कीन गा रहा। उत्पन्न मॉडल का मानचित्र (47) मा फिट करै के लिए यूसीएसएफ चिमेरा मा "फिट मैप" उपकरण का उपयोग करा, प्रोटीन संरचना में सुधार करा, अऊर सहकारक [4×बीसीएचएल ए (मोनोमर लाइब्रेरी अवशेष नाम = बीसीएल), 2×बीपीएच ए (बीपीएच), एक या दुई प्रकार के यूक्यू10 (यू10), एक गैर-हीम आयरन (एफई) अऊर 34-हाइड्रोकारिबोन (क्यूएके)] जोड़ै के लिए कूट (48) का उपयोग करा। चूंकि क्यूएके मोनोमर लाइब्रेरी मा उपलब्ध नाहीं है, यहै कारन ई फीनिक्स (49) मा ईएलबीओडब्ल्यू टूल का उपयोग कइके पैरामीटराइज कीन गा रहा।
अगला, एलएच 1 सबयूनिट का निर्माण कीन गा रहा। शुरुआत मा, PHENIX (49) मा स्वचालित निर्माण उपकरण का उपयोग नक्शा अऊर इनपुट के रूप मा LH1-α अऊर LH1-β प्रोटीन अनुक्रमन का उपयोग कइके LH1 अनुक्रम के हिस्सा का स्वचालित रूप से बनावै के लिए कीन गा रहा। सबसे पूरा LH1 सबयूनिट का चयन करा, ओका निकाला अऊर Coot मा लोड करा, ओमा लापता अनुक्रम का मैन्युअल रूप से जोड़ा, अऊर दुइ BCls a (BCL) अऊर एक स्पिरिलोक्सैन्थिन (CRT) जोड़ै से पहिले पूरी संरचना का मैन्युअल रूप से परिष्कृत करा [संबंधित Rps के अनुसार LH1 कॉम्प्लेक्स अऊर ज्ञात कैरोटेनोइड सामग्री के घनत्व। प्रजाति (17)]। पूरा LH1 सबयूनिट का कॉपी करा, अऊर LH1 घनत्व के बगल के गैर-मॉडल क्षेत्र मा डॉक करै के लिए UCSF चिमेरा "डॉकिंग मैप टूल" का उपयोग करा, अऊर फिर कूट मा परिष्कृत करा; जब तक सब एलएच 1 सबयूनिट मॉडलिंग न होइ जाय तब तक प्रक्रिया दोहरावा जाय। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना के लिए, कूट मा अआवंटित घनत्व का निकाल के, प्रोटीन का यूएससीएफ काइमेरा मैप मा शेष गैर-प्रोटीन घटकन से विभाजित कीन जात है अऊर ऑटोबिल्ड टूल का उपयोग प्रारंभिक मॉडल स्थापित करै के लिए कीन जात है, अऊर शेष सबयूनिट (प्रोटीन-डब्ल्यू) मॉडलिंग। फीनिक्स (49) मा। कूट (48) मा परिणामी मॉडल मा कौनो भी लापता अनुक्रम जोड़ौ, अऊर फिर पूरे सबयूनिट का मैन्युअल रूप से परिष्कृत करा। शेष अआवंटित घनत्व लिपिड (सीडीएल = सीडीएल, पीओपीसी = 6पीएल अऊर पीओपीजी = पीजीटी के पीडीबी मोनोमर लाइब्रेरी आईडी), β-डीडीएम डिटर्जेंट (एलएमटी) अऊर यूक्यू10 अणुओं (यू10) के संयोजन मा फिट बैठत है। PHENIX अनुकूलन (49) अऊर कूट (48) मा मैनुअल अनुकूलन का उपयोग करा ताकि पूरा प्रारंभिक मॉडल का परिपूर्ण कीन जा सके जब तक कि मॉडल आंकड़ा अऊर फिट के दृश्य गुणवत्ता मा अउर सुधार न कीन जा सके। अंत मा, स्थानीय मानचित्र का तेज करै के लिए लोकस्केल (50) का उपयोग करा, अऊर फिर अआवंटित घनत्व अऊर स्वचालित अऊर मैनुअल अनुकूलन के मॉडलिंग के कईयो अन्य चक्र करा।
संबंधित पेप्टाइड, सहकारक अऊर अन्य लिपिड अऊर क्विनोन अपने-अपने घनत्व के भीतर डॉक कीन जात हैं, चित्र 1 अऊर 2 मा देखावा गा है। S18 से S23। अंतिम मॉडल के सांख्यिकीय जानकारी तालिका S1 मा देखावा गा है।
जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट न कीन जाय, तब तक यूवी/विस/एनआईआर अवशोषण स्पेक्ट्रा 250 एनएम से 1000 एनएम तक 1 एनएम अंतराल अऊर 0.1 एस के एकीकरण समय पर एक कैरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एजिलेंट, यूएसए) पर एकत्र कीन गा रहा।
नमूना का क्वार्ट्ज क्यूवेट मा 2 मिमी पथ के साथ 1 के A880 तक पतला करा, अऊर 400 अऊर 1000 एनएम के बीच अवशोषण स्पेक्ट्रम एकत्र करा। गोलाकार डाइक्रोइक स्पेक्ट्रा 20 एनएम मिनट-1 के स्कैन दर पर 400 एनएम अऊर 950 एनएम के बीच 1 एनएम अंतराल पर एक जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर (जास्को, जापान) पर एकत्रित कीन गा रहें।
दाढ़ विलुप्त होवे के गुणांक कोर कॉम्प्लेक्स का लगभग 50 के A880 तक पतला कइके निर्धारित कीन जात है। 990μl बाइंडिंग बफर या मेथनॉल मा 10μl आयतन का पतला करा, अऊर BChl गिरावट का कम से कम करै के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रम का तुरंत एकत्र करा। हर मेथनॉल नमूना के बीसीएचएल सामग्री 54.8 एमएम-1 सेमी-1 के 771 एनएम पर विलुप्त होवे के गुणांक से गणना कीन गै रही, अऊर विलुप्त होवे के गुणांक निर्धारित कीन गा रहा (51)। कोर कॉम्प्लेक्स सांद्रता का निर्धारित करै के लिए मापा गा बीसीएचएल सांद्रता का 32 (आरसी-एलएच114-डब्ल्यू) या 36 (आरसी-एलएच116) से विभाजित करा, जेहिका तब बफर विलुप्त गुणांक मा एकत्रित एकै नमूना के अवशोषण स्पेक्ट्रम का निर्धारित करै के लिए उपयोग कीन जात है। एक बराबर। हर नमूना के लिए तीन दोहराए गए माप लिए गए, अऊर गणना के लिए बीसीएचएल क्यूवाई अधिकतम के औसत अवशोषण का उपयोग कीन गा रहा। 878 एनएम पर मापा गा आरसी-एलएच114-डब्ल्यू का विलुप्त होवे का गुणांक 3280±140 एमएम-1 सेमी-1 है, जबकि 880 एनएम पर मापा गा आरसी-एलएच116 का विलुप्त होवे का गुणांक 3800±30 एमएम-1 सेमी-1 है।
यूक्यू10 (52) मा विधि के अनुसार मापा गा रहा। संक्षेप मा, रिवर्स फेज एचपीएलसी (आरपी-एचपीएलसी) एजिलेंट 1200 एचपीएलसी सिस्टम का उपयोग कइके कीन गा रहा। 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड युक्त 50:50 मेथनॉल:क्लोरोफॉर्म के 50 μl मा आरसी-एलएच116 या आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के लगभग 0.02 एनएमओएल का घोलौ, अऊर 1-1 एमएमएल मा पूर्व-संतुलित बेकमैन कोल्टर अल्ट्रास्फीयर ओडीएस 4 एमएमएल का इंजेक्ट करा। ×25 सेमी कॉलम पर एचपीएलसी विलायक (80:20 मेथनॉल:2-प्रोपेनॉल) मा 40°C। घंटा के लिए 275 एनएम (यूक्यू10), 450 एनएम (कैरोटीनॉयड्स) अऊर 780 एनएम (बीसीएचएल) पर अवशोषण के निगरानी करै के लिए एक एचपीएलसी विलायक मा आइसोक्रेटिक एल्यूशन करा। 25.5 मिनट मा 275 एनएम क्रोमैटोग्राम मा शिखर एकीकृत कीन गा रहा, जेहिमा कौनो अन्य पता लगावै योग्य यौगिक नाहीं रहे। एकीकृत क्षेत्र का उपयोग 0 से 5.8 एनएमओएल (चित्र एस 14) तक शुद्ध मानक के इंजेक्शन से गणना कीन गा अंशांकन वक्र के संदर्भ मा निकाले गए यूक्यू 10 के मोलर मात्रा के गणना करै के लिए कीन जात है। हर नमूना का तीन प्रतिकृतियन मा विश्लेषण कीन गा रहा, अऊर रिपोर्ट कीन गा त्रुटि औसत के एसडी से मेल खात है।
0.1 के अधिकतम Qy अवशोषण के साथ RC-LH1 कॉम्प्लेक्स युक्त एक घोल 30 μM कम घोड़ा हृदय साइटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) अऊर 0 से 50 μMUQ2 (मर्क, यूके) के साथ तैयार कीन गा रहा। माप से पहिले अंधेरे मा पूरा अनुकूलन सुनिश्चित करै के लिए हर यूक्यू 2 सांद्रता मा तीन 1-एमएल नमूना तैयार कीन गा अऊर 4°C पर अंधेरे मा रात भर ऊष्मायन कीन गा। घोल का एक OLIS RSM1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर मा लोड कीन गा रहा जवन 300 एनएम लौ/500 लाइन झंझरी, 1.24 मिमी इनलेट, 0.12 मिमी मध्य अऊर 0.6 मिमी आउटलेट स्लिट से सुसज्जित रहा। उत्तेजना प्रकाश का बाहर करै के लिए नमूना फोटोट्यूब अऊर संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब के प्रवेश द्वार पर एक 600 एनएम लंबा पास फिल्टर रखा जात है। अवशोषण का 0.15 एस के एकीकरण समय के साथ 550 एनएम पर निगरानी कीन गा रहा। उत्तेजना प्रकाश 880 एनएम एम880एफ2 एलईडी (लाइट एमिटिंग डायोड) (थोरलैब्स लिमिटेड, यूके) से एक डीसी2200 नियंत्रक (थोरलैब्स लिमिटेड, यूके) के माध्यम से 90% तीव्रता पर फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से उत्सर्जित कीन जात है अऊर 90° के कोण पर प्रकाश स्रोत से उत्सर्जित कीन जात है। मापने वाली बीम दर्पण के विपरीत है ताकि कौनो भी रोशनी वापस आ सके जवन नमूना द्वारा शुरू मा अवशोषित नाहीं कीन गा रहा। सेकंड के रोशनी से 10 सेकंड पहिले अवशोषण का निगरानी करा। फिर अवशोषण का अंधेरे मा 60 सेकंड के लिए आगे निगरानी कीन गै ताकि ई आकलन कीन जा सके कि क्विनोलोल अनायास साइटोक्रोम सी 23 + का कम करत है (कच्चे डेटा के लिए चित्र एस 8 देखौ)।
डेटा का 0.5 से 10 एस (यूक्यू 2 सांद्रता के आधार पर) के भीतर एक रैखिक प्रारंभिक दर फिट कइके अऊर प्रत्येक यूक्यू 2 सांद्रता मा तीनौ नमूना के दरन का औसतन कइके संसाधित कीन गा रहा। संबंधित विलुप्त होवे के गुणांक द्वारा गणना कीन गा आरसी-एलएच 1 सांद्रता का उपयोग दर का उत्प्रेरक दक्षता मा बदलै के लिए कीन गा रहा, जेका ओरिजिन प्रो 2019 (ओरिजिनलैब, यूएसए) मा प्लॉट कीन गा रहा, अऊर स्पष्ट केएम अऊर केसीएटी मानन का निर्धारित करै के लिए माइकलिस-मेंटेन मॉडल मा फिट कीन गा रहा।
क्षणिक अवशोषण माप के लिए, आरसी-एलएच 1 नमूना का 50 एमएम सोडियम एस्कोर्बेट (मर्क, यूएसए) अऊर 0.4 एमएम टेरब्यूटिन (मर्क, यूएसए) युक्त आईएमएसी बफर मा ~ 2 माइक्रोन तक पतला कीन गा रहा। एस्कॉर्बिक एसिड का उपयोग बलिदान इलेक्ट्रॉन दाता के रूप मा कीन जात है, अऊर टर्ट-ब्यूटाक्लोफेन का उपयोग क्यूबी अवरोधक के रूप मा कीन जात है ताकि ई सुनिश्चित कीन जा सके कि मुख्य आरसी दाता माप प्रक्रिया के दौरान कम (यानी, फोटोऑक्सीडाइज्ड नाहीं) रहा। लगभग 3 मिलीलीटर नमूना एक कस्टम घूर्णन सेल (लगभग 0.1 मीटर व्यास, 350 आरपीएम) मा 2 मिमी ऑप्टिकल पथ लंबाई के साथ जोड़ा जात है ताकि ई सुनिश्चित कीन जा सके कि लेजर पथ मा नमूना के पास उत्तेजना दालन के बीच अंधेरे अनुकूलन के लिए पर्याप्त समय है। टीआई: सैफायर लेजर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, यूएसए) का बढ़ावै के लिए ~100-एफएस लेजर पल्स का उपयोग करा ताकि 1 किलोहर्ट्ज (एनआईआर के लिए 20 एनजे या विस के लिए 100 एनजे) के पुनरावृत्ति दर पर 880 एनएम पर नमूना उत्तेजित कीन जा सके। डेटा एकत्र करै से पहिले, नमूना का लगभग 30 मिनट तक उत्तेजना प्रकाश के संपर्क मा रखौ। एक्सपोजर से क्यूए निष्क्रिय होइ (संभवतः एक या दुइ बार क्यूए कम होइ)। लेकिन कृपया ध्यान दें कि ई प्रक्रिया प्रतिवर्ती है काहे से कि अंधेरे अनुकूलन के एक लंबे समय के बाद, आरसी धीरे-धीरे क्यूए गतिविधि मा वापस आ जाई। -10 से 7000 पीएस के विलंब समय के साथ क्षणिक स्पेक्ट्रा का मापने के लिए एक हेलियोस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम, यूएसए) का उपयोग कीन गा रहा। डेटा सेट का अनग्रुप करै के लिए सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम, यूएसए) का उपयोग करा, फिर मर्ज अऊर मानकीकृत करा। क्षय से संबंधित विभेदक स्पेक्ट्रा प्राप्त करै के लिए संयुक्त डेटा सेट का उपयोग करै के लिए कार्पेटव्यू सॉफ्टवेयर पैकेज (लाइट कन्वर्शन लिमिटेड, लिथुआनिया) का उपयोग करा, या एक फ़ंक्शन का उपयोग करा जवन ओरिजिन (ओरिजिनलैब, यूएसए) मा एकल-तरंग दैर्ध्य वर्णक्रमीय विकास का फिट करै के लिए उपकरण प्रतिक्रिया के साथ कई घातांकन का संलग्न करत है।
जैसा कि ऊपर बतावा गा है (53), एक प्रकाश संश्लेषक फिल्म जेहिमा एलएच 1 कॉम्प्लेक्स रहा जेहिमा आरसी अऊर परिधीय एलएच 2 एंटीना दुनौ के कमी रही। झिल्ली का 20 एमएम ट्रिस (पीएच 8.0) मा पतला कीन गा रहा अऊर फिर 2 मिमी ऑप्टिकल पथ के साथ एक क्वार्ट्ज क्यूवेट मा लोड कीन गा रहा। -10 से 7000 पीएस के विलंब समय के साथ 540 एनएम पर नमूना का उत्तेजित करै के लिए एक 30 एनजे लेजर पल्स का उपयोग कीन गा रहा। आरपीएस के लिए वर्णित डेटा सेट का संसाधित करा। पाल नमूना।
झिल्ली का 4°C पर 2 घंटा के लिए 150,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली बनावा गा रहा, अऊर फिर 880 एनएम पर ओकर अवशोषण 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) अऊर 200 एमएम एनएसीएल मा फिर से निलंबित कीन गा रहा। 4°C पर अंधेरे मा 1 घंटा के लिए 2% (w/v) β-DDM मा धीरे-धीरे हिला के झिल्ली का भंग करा। नमूना 100 एमएम ट्राइएथिलैमोनियम कार्बोनेट (पीएच 8.0) (टीईएबी; मर्क, यूके) मा 2.5 मिलीग्राम एमएल-1 (बायो-रेड विश्लेषण) के प्रोटीन सांद्रता तक पतला कीन गा रहा। आगे के प्रसंस्करण पहिले से प्रकाशित विधि (54) से कीन गा रहा, 50 μg प्रोटीन के कुल 50 μl TEAB मा पतला करै से शुरू कीन गा रहा जेहिमा 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (मर्क, यूके) रहा। सेकंड के लिए सोनिकेशन के बाद, ई 30 मिनट के लिए 37°C पर 5 एमएम ट्रिस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फीन (मर्क, यूके) के साथ कम कीन गा रहा। एस-एल्काइलेशन के लिए, नमूना का 10 एमएम मिथाइल एस-मिथाइलथियोमेथेनसल्फोनेट (मर्क, यूके) के साथ ऊष्मायन करा अऊर कमरा के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 एमएम आइसोप्रोपेनॉल स्टॉक घोल से जोड़ा। प्रोटिओलाइटिक पाचन 2 μg ट्रिप्सिन/एन्डोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रण (प्रोमेगा यूके) जोड़ के कीन गा रहा अऊर 37°C पर 3 घंटा तक ऊष्मायन कीन गा रहा। लॉरेट सर्फेक्टेंट का 50 μl एथिल एसीटेट अऊर 10 μl 10% (v/v) एलसी ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (टीएफए; थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) जोड़ के अऊर 60 सेकंड के लिए भंवर लगा के निकाला गा रहा। चरण पृथक्करण का 5 मिनट के लिए 15,700 आरसीएफ पर अपकेंद्रण द्वारा बढ़ावा दीन गा रहा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, पेप्टाइड युक्त निचले चरण का सावधानी से आकांक्षा अऊर नमक मुक्त करै के लिए एक सी 18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) का उपयोग कीन गा रहा। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन से सुखावै के बाद, नमूना 0.5% टीएफए अऊर 3% एसीटोनाइट्रिल मा घुलावा गा रहा, अऊर 500 एनजी का नैनोफ्लो आरपी क्रोमैटोग्राफी द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ जोड़ा गा रहा, जेहिमा पहिले से विस्तृत सिस्टम पैरामीटरन का उपयोग कीन गा रहा।
आरपीएस के खोज करै के लिए प्रोटीन पहचान अऊर मात्रा निर्धारण के लिए मैक्सक्वांट v.1.5.3.30 (56) का उपयोग करा। पलुस्ट्रिस प्रोटीओम डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स डेटा का डेटासेट पहचानकर्ता PXD020402 के तहत PRIDE पार्टनर रिपॉजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) के माध्यम से प्रोटिओमएक्सचेंज एलायंस मा जमा कीन गा है।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित आरपीएलसी द्वारा विश्लेषण के लिए, आरसी-एलएच 1 कॉम्प्लेक्स जंगली-प्रकार आरपीएस से तैयार कीन गा रहा। पहिले से प्रकाशित विधि (16) का उपयोग करत हुए, पलस्ट्रिस कोशिका मा उत्पादित प्रोटीन सांद्रता 20 एमएम हेप्स (पीएच 7.8), 100 एमएम एनएसीएल अऊर 0.03% (डब्ल्यू/वी) β- (बायो-रेड विश्लेषण)) डीडीएम मा 2 मिलीग्राम एमएल-1 रहा। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, अवक्षेपण विधि से 10 μg प्रोटीन निकालै के लिए 2D शुद्धिकरण किट (जीई हेल्थकेयर, यूएसए) का उपयोग करा, अऊर अवक्षेप का 20 μl 60% (v / v) फॉर्मिक एसिड (FA), 20% (v / v) एसीटोनाइट्रिल अऊर 20% (v/v) पानी मा घुलावा। पांच माइक्रोलीटर का विश्लेषण आरपीएलसी (डायोनेक्स आरएसएलसी) द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मैक्सिस यूएचआर-टीओएफ, ब्रुकर) के साथ जोड़ा गा रहा। 60°C अऊर 100μlmin -1 पर अलगाव के लिए MabPac 1.2×100 मिमी कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) का उपयोग करा, 85% (v / v) विलायक A [0.1% (v / v) FA अऊर 0.02% (V/v) TFA जलीय घोल] के ढाल के साथ विलायक (5% Bv) [0.1%(v/v) एफए अऊर 0.02%(v/v) 90%(v/v) एसीटोनाइट्रिल टीएफए मा] 60 मिनट से अधिक समय तक मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत अऊर डिफ़ॉल्ट पैरामीटरन का उपयोग करत हुए, मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 से 2750 एम/जेड (मास-चार्ज अनुपात) प्राप्त करत है। एक्सपासी जैव सूचना विज्ञान संसाधन पोर्टल फाइंडपेप्ट टूल (https://web.expasy.org/findpept/) के मदद से, परिसर के उप-इकाइयन मा द्रव्यमान स्पेक्ट्रम का मैप करा।
कोशिका 100 मिलीलीटर एनएफ-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) या उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाश के तहत 72 घंटे तक उगाई गईं। 100 मिलीलीटर स्क्रू-टॉप बोतल (23) मा एम22 माध्यम (एम22 माध्यम जेहिमा अमोनियम सल्फेट छोड़ा जात है अऊर सोडियम सक्सीनेट का सोडियम एसीटेट से बदल दीन जात है)। पांच 30-एस चक्रन मा, कोशिकाओं का lyse करै के लिए 1:1 के आयतन अनुपात मा 0.1 माइक्रोन ग्लास बीड्स का बीडिंग कीन गा रहा अऊर 5 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा कीन गा रहा। अघुलनशील पदार्थ, अखंड कोशिका अऊर कांच के मोती का एक बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज मा 10 मिनट के लिए 16,000 आरसीएफ पर अपकेंद्रण द्वारा हटावा गा रहा। झिल्ली का 10 घंटा के लिए 40/15% (w/w) सुक्रोज ढाल के साथ 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 8.0) मा 100,000 आरसीएफ के साथ टीआई 70.1 रोटर मा अलग कीन गा रहा।
जैसा कि हमरे पिछले काम मा वर्णित है, PufW (16) पर His टैग का इम्यूनोडिटेक्शन। संक्षेप मा, शुद्ध कोर कॉम्प्लेक्स (11.8 एनएम) या 2x एसडीएस लोडिंग बफर (मर्क, यूके) मा आरसी (कम अंतर स्पेक्ट्रम का घटा के ऑक्सीकरण अऊर दागदार जेल पर भार से मेल खात ऑक्सीकरण द्वारा निर्धारित) के एकै सांद्रता युक्त झिल्ली का दुई बार पतला कीन जात है। प्रोटीन का एक प्रतिकृति 12% बिस-ट्रिस न्यूपेज जेल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर अलग कीन गा रहा। आरसी-एल सबयूनिट का लोड अऊर विजुअलाइज करै के लिए एक जेल का कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रेड, यूके) से दाग दीन गा रहा। दूसर जेल पर प्रोटीन का इम्यूनोएसे के लिए मेथनॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) मा स्थानांतरित कीन गा रहा। पीवीडीएफ झिल्ली का 50 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 एमएम एनएसीएल, 0.2% (वी / वी) ट्वीन-20 अऊर 5% (डब्ल्यू / वी) स्किम्ड मिल्क पाउडर मा अवरुद्ध कीन गा रहा, अऊर फिर एंटी-हिस प्राथमिक एंटीबॉडी (पतला एंटीबॉडी बफर [एमएचसीएल (एमएम-एचसीएल) मा) के साथ ऊष्मायन करा गा रहा। 7.6), 150 एमएम NaCl अऊर 0.05% (v/v) ट्वीन-20] 1:1000 A190-114A, बेथिल लेबोरेटरीज, यूएसए) मा 4 घंटा के लिए। एंटीबॉडी बफर मा 5 मिनट के लिए 3 बार धोवै के बाद, झिल्ली का हॉर्सरैडिश पेरोक्सिडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूके) एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर मा 1:10,000 पतला) के साथ जोड़ा गा रहा, पता लगावै के अनुमति देय के लिए इन्क्यूबेट (एंटीबॉडी बफर मा 3 धोवै के बाद) डब्ल्यूटीएआर ईएसटीएआर 2 का उपयोग करत हुए। केमिलुमिनेसेंस सब्सट्रेट (सायनजेन, इटली) अऊर अमेरशम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेयर, यूके)।
हर दागदार जेल या इम्यूनोएसे लेन के तीव्रता वितरण का खींच के, शिखर के नीचे के क्षेत्र का एकीकृत कइके अऊर आरसी-एल (दागदार जेल) अऊर प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्यूनोएसे) के तीव्रता अनुपात के गणना कइके, इमेजजे (57) मा छवि का संसाधित करा। ई अनुपातन का दाढ़ अनुपात मा बदला गा रहा, ई मान के कि शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू नमूना मा आरसी-एल से प्रोटीन-डब्ल्यू का अनुपात 1:1 रहा अऊर तदनुसार पूरे डेटा सेट का सामान्यीकृत कीन गा रहा।
यहि लेख के लिए पूरक सामग्री के लिए, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 देखौ
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प्रतिक्रिया केंद्र मा प्रकाश जाल 1 परिसर के उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना क्विनोन गतिकी मा नई अंतर्दृष्टि प्रदान करत है।
डेविड जेके स्वेनसबरी, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम. फैरीज, डेरियस एम. नीडज़्वेड्ज़की, एलिजाबेथ सी. मार्टिन, डेविड ए. फार्मर, लोर्ना ए. मेलोन, रेबेका एफ. थॉम्पसन, नील ए. रैनसन, डेनियल पी कैनिफ, मार्क जे. डिकमैन, डेवी होल्टन, क्रिस्टीन किरमा, हंटर, हंटर हंटर।
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